Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
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이 작품 농업 과학 기술 개발 (프로젝트 번호에 대 한 협동 연구 프로그램의 지원으로 수행 되었다 PJ010953012018), 농촌 진흥청과 국립 연구 재단 (한국) 그랜트 과학기술부와 ICT (No. 2016R1E1A1A02922014), 한국.

1입니다. 애기 식물의 성장
<ol><li>1 L Gamborg B5 준비 (B5) 매체 B5 매체의 3.2 g를 추가 하 여 비타민, 자당의 20 g, 2-(N-morpholino) 탄 술 폰 산 (MES), 이온을 제거 된 물 약 800 mL의 0.5 g과 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 추가 더 이온된 물 phytoagar 고압 121 ° c.에 15 분의 1 나 추가 8 g 총 볼륨을가지고</li>
	<li>55 ° C까지 냉각 및 깨끗 한 벤치에 페 트리 접시 (지름에서 9 c m, 높이 1.5 c m) B5 매체의 20-25 mL를 붓고...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

우리는 엽록체에 단백질 가져오기 공부 애기 의 protoplasts의 사용에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 메서드는 강력한 단백질 가져오기 프로세스를 조사. 이 간단 하 고 다재 다능 한 기술은 엽록체를 의도 화물 단백질을 대상으로 조사 하기 위한 유용 합니다. 이 메서드를 사용 하 여, protoplasts는 매우 일찍 완전히 성숙한 잎에서 배열 하는 많은 다른 성장 단계에서 식물에서 얻을 수...

엽록체는 식물에서 가장 중요 한 세포 중 하나입니다. 엽록체의 주요 기능 중 하나는 광합성1수행입니다. 엽록체는 또한 지방산, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 수많은 이차 대사 산물1,2의 생산에 대 한 많은 다른 생 화 확 적인 반응을 실시합니다. 모든이 반응은 엽록체 단백질의 다른 종류의 많은 수를 필요로합니다. 그러나, 엽록체 게놈에는 약 100만 유전자3,4포함 되어 있습니다. 따라서, 엽록체는 cytosol에서 그들의 단백질의 대부분을 가져와야 합니다. 사실, 대부분의 엽록체 단백질 번역4,,56후는 cytosol에서 가져올 수을 표시 했다. 식물 세포에는 엽록체에는 cytosol에서 단백질을 가져올 특정 메커니즘이 필요 합니다. 그러나, 이러한 단백질 가져오기 메커니즘 지난 몇 십년에 대 한 조사는, 비록 우리가 아직 이해 하지 않습니다 완전히 그들 분자 수준에서. 여기, 우리 protoplasts를 준비 하 고 protoplasts에 있는 유전자를 표현 하는 것에 대 한 자세한 방법을 제공 합니다. 이 메서드는 elucidating 자세히 엽록체로 단백질 가져오기 기본 분자 메커니즘에 대 한 중요 한 될 수 있습니다.
단백질 가져오기는 많은 다른 방법을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 생체 외에서 단백질 가져오기 시스템7,8의 사용을 포함. 체 외에서이 방법을 사용 하 여-번역 된 단백질 선구자는 순화 된 엽록체에 생체 외에서인 큐베이 팅 및 단백질 가져오기 SDS 페이지 뒤에 서쪽 오 점 분석에 의해 분석 된다. 이 방법의 장점은 엽록체로 단백질의 각 단계 세부에서 공부 될 수 있다입니다. 따라서,이 방법은 널리 사용 되었습니다 단백질 가져오기 분자 기계 구성 요소를 정의 하 고 교통 펩 티 드에 대 한 시퀀스 정보 부. 더 최근에, 잎 조직에서 protoplasts의 사용을 포함 하는 또 다른 방법은 개발 되었다 고 단백질 가져오기 엽록체9,10으로 공부를 널리 사용 되고있다. 이 방법의 장점은 그대로 세포의 생체 외에서 시스템 보다 가까이 세포 환경을 제공 하는 protoplasts. 따라서, 원생 동물 시스템 관련된 cytosolic 이벤트 등 어떻게 신호를 표적으로 하기의 특이성 결정은이 과정의 많은 추가 측면을 해결 수 있습니다. 여기, 우리는 단백질 가져오기 엽록체로 공부 하는 protoplasts의 사용에 대 한 자세한 프로토콜 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

엽록체는 식물, 광합성 등 많은 보조 metabolites의 지질 생산에에서 다양 한 세포질 과정을 담당 하는 필수적인 세포 기관이 이다. 엽록체는 이러한 다양 한 생리 적 과정에 대 한 단백질의 많은 수를 요구 한다. 이상의 엽록체 단백질의 95 %cytosolic 리보솜에서 번역 후 핵 인코딩되고는 cytosol에서 엽록체에 가져온 있습니다. 따라서, 적절 한 가져오기 또는 엽록체를이 핵 인코딩 엽록체 단백질의 엽록체 식물 세포의 적절 한 작동에 필수적입니다. 핵 인코딩 엽록체 단백질 포함 엽록체를 특정 대상에 대 한 신호 순서. 분자 기계는 엽록체 또는 cytosol로 이러한 신호를 인식 하 고 가져오기 프로세스를 수행. 단백질 가져오기 또는 vivo에서엽록체를 타겟팅의 메커니즘을 조사, 우리 신속 하 고 효율적인 원생 동물 기반 방법을 개발 애기의 엽록체로 단백질 수입 분석 하. 이 방법에서는, 우리 애기의 잎 조직에서 분리 된 protoplasts를 사용 합니다. 여기, 우리는 단백질 엽록체로 가져올 메커니즘을 조사 하기 위해 protoplasts를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

엽록체에 단백질의 수입 두 가지 방법을 사용 하 여 시험 될 수 있다: SDS 페이지 중재 분리 후 형광 현미경 검사 법 및 immunoblot 분석. 여기, 우리는 Rbc 사용-nt:GFP, 융합 건설 Rbc GFP 융합 교통 펩 티 드를 포함 하는 79 N 맨끝 아미노산 잔류물을 인코딩. 대상 단백질 Rbc에서에서 녹색 형광 신호 단백질은 엽록체로 가져오면-형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 ?...

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Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

여기는 못 중재 변환 메서드를 사용 하 여 protoplasts로 단백질을 표현 하는 프로토콜에 설명 합니다. 관심, 단백질 및 단백질 현지화 및 다양 한 실험 조건에 대 한 가져오기 프로세스의 효율적인 조사의 쉬운 표현 제공 합니다 vivo에서.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

이 신비는 엽록소에 단백질 입력과 같은 세포 생물학의 필드에 있는 몇몇 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 엽록소에 단백질 입력이 en vivo 조건하에서 연구될 수 있다는 것입니다. 이준호와 강향주가 수술절차를 시연할 예정이다.우선, 2주 된 식물에서 1~2개의 B5 플레이트에서 잎 조직을 수확하십시오. 수술용 칼을 사용하여 잎을 수확하고 효소 용액 25밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 튜브를 회전 셰이커에 수평으로 놓고 어둠 속에서 섭씨 22도에서 부드러운 교양으로 배양하여 8~12시간 동안 만 만 잎이와 줄기만 용액에 남아 있습니다.인큐베이션을 완료한 후, 140마이크로미터 모공 크기의 메쉬를 통해 방출된 프톱라스트를 함유한 효소 용액을 신선한 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 50 밀리리터 원추형 튜브에 21% 자당 용액의 15 밀리리터 위에 신중하게 솔루션을 레이어링합니다. 가장 낮은 가속 및 감속 설정으로 98 gs에서 스윙 버킷 로터에서 튜브를 원심 분리합니다.그 후, 파투라 파이펫을 사용하여 효소 용액을 함유하는 최상위 층과 효소 용액과 자당 용액 사이의 인터페이스에서 프톱서스트를 조심스럽게 제거합니다. 이 솔루션을 W5 용액 30밀리리터를 포함하는 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 혼합하는 것을 반전시십시오. 6 분 동안 51 gs에서 튜브를 원심 분리합니다.파이펫을 사용하여 펠릿의 프톱라스트를 방해하지 않고 이 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. W5 용액 25밀리리터를 추가하고 프토플라스트를 부드럽게 다시 중단합니다. 안정화를 위해 4°C 의 냉장고에 최소 1시간 동안 인큐베이션을 사용해 보임합니다.섭씨 4도 의 배양 후, 2 분 동안 46 gs에서 그들을 원심분리하여 프토플라스트를 완전히 펠렛. 수퍼네텐트를 완전히 제거하고 프토플라스트 펠릿에 MANG 솔루션을 추가하여 밀리리터당 6회에서 10배까지 5회 달성합니다. 파이펫을 사용하여 플라즈마 DNA 10마이크로그램과 300마이크로리터의 프토플라스트 용액을 신선한 13밀리리터 라운드 바닥 튜브에 추가합니다.튜브를 손으로 부드럽게 회전한 다음 즉시 새로 준비된 40% PEG 용액 300마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 거의 수평으로 기울이고 손으로 여러 번 부드럽게 회전하여 완전히 섞습니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.그런 다음 W5 용액 1 밀리리터를 넣고 튜브를 손으로 부드럽게 회전시켜 완전히 섞습니다. 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 처음 1.5 밀리리터를 추가한 다음 W5의 밀리리터 2개를 추가하고 최종 첨가 및 혼합 후 30분 동안 배양하여 두 번 더 반복합니다.46 gs에서 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다. 펠릿에 W5 용액 2밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어, 하지만 완전히 이전과 같은 방식으로 섞습니다. 어두운 챔버에서 섭씨 22도에서 18 시간 동안 배양하십시오.플로레시언 현미경을 사용하여 단백질 수입을 분석하려면 트리밍 팁이 있는 파이펫을 사용하여 프로토프스트 용액 10마이크로리터를 유리 슬라이드에 배치합니다. 커버 슬립을 사용하여 프스토플라스트가 손상되지 않도록 솔루션을 조심스럽게 덮습니다. 녹색 형광 단백질과 엽록소 자동 형광을 관찰하기 위해 설정된 흥분 입학 필터와 형광 현미경의 단계에 슬라이드를 놓습니다.냉각 충전 커플 장치 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 상상하는 편집 소프트웨어를 사용하여 의사 색상 이미지를 생성합니다. 총 단백질 추출 및 면역 블로팅의 경우, 프토플라스트 용액에서 1밀리리터를 제거하고 나머지 1밀리리터를 섞는다. 이 프토플라스트 용액을 원심분리기 튜브와 원심분리기46gs로 4분간 전송합니다.원심분리를 완료한 후 상체를 제거하고 80마이크로리터의 디나처레이션 버퍼를 추가합니다. 소용돌이는 5초 동안 활발하게 합니다. XDS 샘플 버퍼 5개에 넣고 잘 섞고 10분간 끓여 자연을 제거합니다.표준 STS 페이지와 항GFP 항체를 가진 면역 블로팅으로 진행하십시오. RbcS 및 TGFT는 GFP에 융합된 이동 펩티드를 함유하는 RBCS의 79말단 말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 융합 구조로, 플로레스션 현미경 검사법과 면역블로팅에 의해 엽록소로 단백질의 수입을 연구하는 데 사용되었다. 플로레시언 현미경검사법에 의해 검사될 때, 대상 단백질의 녹색 형광 신호는 엽록소 자동 동체로부터의 적색 형광 신호와 병합되어 단백질이 엽록소로 수입함을 나타냅니다.총 단백질을 분리한 후 면역블롯에서 두 개의 단백질 밴드가 관찰되어 단백질이 엽록소로 적절히 수입되었다는 것을 보여줍니다. 상부 대역은 엽록소로 가져온 후 처리된 형태에 전체 길이 전구체 및 하부 대역에 해당한다. 단백질의 가공된 형태의 양은 시간에 따라 증가하여 단백질이 엽록소로 수입된다는 것을 시사합니다.이 발달에서, 이 기술은 세포 생물학의 필드에 있는 연구원이 아라비도시스에 있는 단백질 피곤또는 막 스레드 따기를 탐구하는 도로를 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...