Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Dette arbeidet ble utført med støtte Cooperative Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development administrasjon og National Research Foundation (Korea) stipendet finansiert av departementet for vitenskap og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sør-Korea.

1. vekst av Arabidopsis planter
<ol><li>Forberede 1 L Gamborg B5 (B5) medium ved å legge til 3,2 g B5 middels inkludert vitaminer, 20 g sukrose, 0,5 g 2-(N-morpholino) etan sulfonsyre (MES) til ca 800 mL deionisert vann, og justere pH til 5.7 med kaliumhydroksid (KOH). Legg til mer vaskebuffer vann bringe det totale volumet til 1 L. legge til 8 g phytoagar og autoklav i 15 min på 121 ° C.</li>
	<li>Tillate medium å kjøle ned til 55 ° C og hell 20-25 mL B5 mediet i en Petriskål (9 cm i diameter, 1,5 cm i høyden)...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Vi har gitt en detaljert protokoll for bruk av protoplasts av Arabidopsis å studere protein import i chloroplasts. Denne metoden er kraftig for å undersøke protein importprosessen. Denne enkle, allsidig teknikken er nyttig for å undersøke målretting av de tiltenkte Last proteinene til chloroplasts. Bruker denne metoden, er protoplasts forberedt fra blad vev Arabidopsis11,12 som kan fås fra planter i mange forskjellige vekst stadier, fra v...

Chloroplast er en av de viktigste organeller i planter. En av Hovedfunksjonene til chloroplasts er å gjennomføre fotosyntese1. Chloroplasts også utføre mange andre biokjemiske reaksjoner for produksjon av fettsyrer, aminosyrer, nukleotider og mange sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaksjonene krever chloroplasts et stort antall forskjellige typer proteiner. Chloroplast genomet inneholder imidlertid bare ca 100 gener3,4. Chloroplasts må derfor importere fleste av sine proteiner fra stoffer. Faktisk ble de fleste chloroplast proteiner vist importeres fra stoffer etter oversettelse4,5,6. Anlegget celler krever spesifikke mekanismene importere proteiner fra stoffer til chloroplasts. Men selv om disse protein import mekanismene er gransket for de siste tiårene, forstår vi fortsatt ikke fullt ut dem på molekylært nivå. Her gir vi en detaljert metode for utarbeidelse protoplasts og exogenously uttrykke genene i protoplasts. Denne metoden kan være nyttig for Klargjørende molekylære mekanismer underliggende protein import i chloroplasts i detalj.
Protein import kan studeres ved hjelp av mange ulike tilnærminger. En av disse metodene innebærer bruk av en i vitro protein import system7,8. Bruker denne tilnærmingen, i vitro-oversatt protein prekursorer er ruges med renset chloroplasts i vitro, og protein import analyseres av SDS side etterfulgt av western blot analyse. Fordelen med denne tilnærmingen er at hvert trinn av protein import i chloroplasts kan bli studert i detalj. Dermed har denne metoden vært mye brukt til å definere komponentene i protein import molekylær maskiner og dissekere oppstartsrekkefølgen for transitt peptider. Flere nylig, en annen tilnærming med bruk av protoplasts fra blad vev ble utviklet og det har blitt mye brukt til å studere protein import i chloroplasts9,10. Fordelen med denne tilnærmingen er at protoplasts gir et mobilnettet miljø som er nærmere til intakt celler enn i vitro system. Dermed tillater protoplast systemet oss å ta mange flere aspekter av denne prosessen, som tilknyttede cytosolic hendelsene og hvordan spesifisiteten av målretting signaler bestemmes. Her presenterer vi en detaljert protokoll for bruk av protoplasts å studere protein import i chloroplasts.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Chloroplast er en viktig organelle som er ansvarlig for ulike cellulære prosesser i planter, som fotosyntesen og produksjon av mange sekundære metabolitter og lipider. Chloroplasts krever et stort antall proteiner for disse ulike fysiologiske prosesser. Over er 95% av chloroplast proteiner kjernen-kodet og importeres til chloroplasts fra stoffer etter oversettelse på cytosolic ribosomer. Dermed er riktig import eller målretting av disse kjernen-kodede chloroplast proteiner til chloroplasts avgjørende for riktig funksjon av chloroplasts samt anlegget celle. Kjerne-kodede chloroplast proteiner inneholder signal sekvenser for bestemte målretting for chloroplasts. Molekylær maskiner lokalisert til chloroplast eller stoffer gjenkjenne disse signalene og utføre importen. Undersøke mekanismer av protein import eller målretting chloroplasts i vivo, utviklet vi en rask, effektiv protoplast-basert metode for å analysere protein import i chloroplasts av Arabidopsis. I denne metoden bruker vi protoplasts isolert fra blad vev av Arabidopsis. Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke protoplasts for å undersøke mekanismen som proteiner er importert til chloroplasts.

Import av proteiner i chloroplasts kan undersøkes med to tilnærminger: fluorescens mikroskopi og immunoblot analyse etter SDS-side-mediert separasjon. Her vi brukte RbcS-nt:GFP, en fusjon konstruere koding 79 N-terminal aminosyre rester av RbcS inneholder transitt peptid del GFP. Når proteiner importeres til chloroplasts, grønne fluorescens signaler fra målet protein RbcS-nt:GFP skal flette med røde fluorescerende signalene fra klorofyll auto-fluorescens, fordi undersøkt av fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Her beskriver vi en protokoll for å uttrykke proteiner i protoplasts ved hjelp av PEG-mediert transformasjon metode. Metoden gir enkel uttrykk for proteiner av interesse og effektiv undersøkelse av protein lokalisering og importprosessen for ulike eksperimentelle forhold i vivo.

Studere Protein Import i Chloroplasts bruker Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Dette mysteriet kan bidra til å svare på noen spørsmål innen cellebiologi som proteininndata i kloroplaster. Den største fordelen med denne teknologien er at proteininndata i kloroplaster kan studeres under en vivo forhold. Å demonstrere prosedyren vil være Junho Lee og Hyangju Kang, to innlegg fra laboratoriet mitt.Til å begynne med høste intakt bladvev fra to uker gamle planter fra en til to B5 plater. Bruk en kirurgisk kniv til å høste bladene og legg dem i et 50 milliliter konisk rør som inneholder 25 milliliter enzymløsning. Plasser røret horisontalt på en roterende shaker og inkuber med mild agitasjon ved 22 grader Celsius i mørket i åtte til 12 timer til bare petioles og stengler forblir i løsningen.Etter endt inkubasjon filtrerer du enzymoppløsningen som inneholder frigjorte protoplaster gjennom et nett i 140 mikrometer porestørrelse i en frisk petriskål. Lag deretter forsiktig løsningen på toppen av 15 milliliter med 21% sukroseløsning i et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger røret i en svingende bøtterotor ved 98 gs i 10 minutter med de laveste akselerasjons- og retardasjonsinnstillingene.Deretter bruker du paturapipetten til å forsiktig fjerne protoplastene fra det øverste laget som inneholder enzymløsning og fra grensesnittet mellom enzymeløsningen og sukroseløsningen. Overfør denne løsningen til et konisk rør på 50 milliliter som inneholder 30 milliliter W5-oppløsning og inverter røret for å blande. Sentrifuger røret ved 51 gs i seks minutter.Bruk en pipette til å kaste denne supernatanten forsiktig uten å forstyrre protoplastene i pelleten. Tilsett 25 milliliter W5-oppløsning og forsiktig re-suspendere protoplastene. For stabilisering, inkuber i en fire Celsius kjøleskap i minst en time.Etter fire grader Celsius inkubasjon, pellet protoplastene helt ved å sentrifugere dem på 46 gs i to minutter. Fjern forsiktig supernatent helt og tilsett MANG-løsningen til protoplastpellet for å oppnå fem ganger ti til seks per milliliter. Bruk en pipette til å legge til 10 mikrogram plasma-DNA og 300 mikroliter protoplastløsning til et friskt 13 milliliter rundt bunnrør.Bland ved å rotere rørene forsiktig for hånd og tilsett deretter umiddelbart 300 mikroliter nyoppgjort 40% PEG-løsning. Bland helt ved å vippe røret nesten horisontalt og rotere det forsiktig flere ganger for hånd. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.Tilsett deretter en milliliter W5-oppløsning og bland helt ved å rotere røret forsiktig for hånd som tidligere. Inkuber prøven i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta to ganger til med å legge til første 1,5 milliliter og deretter to milliliter W5 og etter det endelige tillegget og blandingen, inkuber i 30 minutter.Sentrifuger røret ved 46 gs i fire minutter og kast deretter overnatanten. Tilsett to milliliter W5-løsning til pelleten og bland forsiktig, men helt, på samme måte som tidligere. Inkuber ved 22 grader Celsius i et mørkt kammer i 18 timer.For å analysere proteinimporten ved hjelp av florescence mikroskopi, bruk en pipette med en trimmet spiss for å plassere 10 mikroliter av protoplastløsningen på et glasssklie. Bruk en dekselslipp til å dekke løsningen forsiktig for å unngå å skade protoplastene. Plasser lysbildet på scenen av et fluorescensmikroskop med et eksitasjonsopptaksfilter som er satt for å observere grønt fluorescerende protein og klorofyll autofluorescens.Bruk et avkjølt ladeparenhetskamera til å ta bilder og behandle dem ved hjelp av en forestill deg redigeringsprogramvare for å produsere pseudo-fargebilder. For total proteinekstraksjon og immunoblotting, fjern en milliliter fra protoplastoppløsningen og bland resten av en milliliter. Overfør denne protoplastløsningen til et sentrifugerør og sentrifuge ved 46 gs i fire minutter.Fjern supernatanten etter å ha fullført sentrifugering og tilsett 80 mikroliter denaturation buffer. Vortex vigoriously i fem sekunder. Tilsett fem XDS prøvebuffer, bland godt og kok i 10 minutter for å denatur.Fortsett med standard STS-side og immunoblotting med anti-GFP-antistoff. RbcS og TGFT, en fusjonskonstruksjon som koder de 79 terminale aminosyrerester av RBCS som inneholder transittpeptidet smeltet til GFP, ble brukt til å studere import av proteiner til kloroplaster ved florescence mikroskopi og immunoblotting. Når undersøkt av florescence mikroskopi, grønne fluorescerende signaler fra målet protein fusjonert med de røde fluorescerende signaler fra klorofyll autoflorescence indikerer protein import til kloroplaster.Etter å ha isolert totalt protein observeres to proteinbånd i immunoblot, noe som viser at et protein ble riktig importert til kloroplaster. Det øvre båndet tilsvarer full lengde forløper og det nedre båndet til den behandlede formen etter import til kloroplaster. Mengden av den behandlede formen av proteinet økte på en tidsavhengig måte, noe som tyder på at proteinet importeres til kloroplaster.På denne utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen cellebiologi for å utforske protein slitsomme eller membrantrådplukking i Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...