Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.

1. рост растения арабидопсис
<ol><li>Подготовка 1 Л Gamborg B5 (B5) среднего, добавив 3.2 g B5 среды включая витамины, 20 г сахарозы, 0,5 г этана 2-(N-morpholino) сульфоновой кислоты (MES) до приблизительно 800 мл деионизированной воды и скорректировать рН до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить больше деионизирован...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в...

Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез1. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты1,2. Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов3,4. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В самом деле большинство белков хлоропласта были продемонстрированы быть импортированы из цитозоль после перевода4,5,6. Клетки растений требуют конкретных механизмов для импорта белки из цитозоль в хлоропластах. Однако хотя эти механизмы импорта белка были изучены в течение последних нескольких десятилетий, мы до сих пор не полностью понимаем их на молекулярном уровне. Здесь мы предоставляем подробный метод для подготовки протопласта и экзогенно выражая генов в протопласта. Этот метод может быть ценным для выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе белка импорта в хлоропластах в деталях.
Белка импорта могут быть изучены с использованием многих различных подходов. Один из этих методов включает в себя использование в vitro белка импорта7,системы8. Используя этот подход, в пробирке-перевод белка прекурсоров инкубируют с очищенной хлоропластов в пробирке, и белка импорта анализируемой SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой. Преимуществом этого подхода является, что может подробно каждый шаг белка импорта в хлоропластах. Таким образом этот метод широко используется для определения компонентов молекулярного механизма импорта белка и анализировать сведения о последовательности для транзита пептидов. Совсем недавно был разработан еще один подход с использованием протопласта из листьев тканей, и он стал широко используется для изучения белков импорта в хлоропластах9,10. Преимуществом этого подхода является, что протопласта обеспечивают клеточной среды, которая ближе к нетронутым клеток, чем система, в пробирке . Таким образом система протопластов позволяет нам решать многие дополнительные аспекты этого процесса, например связанные события цитозольной и как определяется специфика ориентации сигналов. Здесь мы представляем подробный протокол для использования протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.

Импорт белков в хлоропластах может проверяться с помощью двух подходов: флуоресцентной микроскопии и immunoblot анализ после разъединения SDS-страницы опосредованной. Здесь, мы использовали БС-nt:GFP, слияние построить кодирования 79 N-терминальный аминокислотных остатков RbcS, ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Эта тайна может помочь ответить на несколько вопросов в области клеточной биологии, таких как ввод белка в хлоропласты. Основным преимуществом этой технологии является то, что ввод белка в хлоропласты может быть изучен в условиях en vivo. Демонстрация процедуры будет Junho Ли и Hyangju Кан, два поста выходы из моей лаборатории.Для начала, урожай нетронутыми листовых тканей из двухнедельных растений от одной до двух пластин B5. Используйте хирургический нож, чтобы собрать листья и поместить их в 50 миллилитров конической трубки, содержащей 25 миллилитров ферментного раствора. Поместите трубку горизонтально на роторный шейкер и инкубировать с нежным возбуждением при 22 градусах по Цельсию в темноте в течение восьми-12 часов, пока в растворе не останутся только петиолы и стебли.После завершения инкубации, фильтр ферментный раствор, содержащий выпущенные протопласты через сетку размером 140 микрометров в свежую чашку Петри. Затем осторожно слой раствора поверх 15 миллилитров 21% раствора сахарозы в 50 миллилитров конической трубки. Центрифуга трубки в размахивая ротор ведро на 98 г в течение 10 минут с наименьшим ускорением и замедлением настройки.После этого используйте патура пипетку, чтобы тщательно удалить протопласты из верхнего слоя, содержащего ферментный раствор, и из интерфейса между раствором ферментов и раствором сахарозы. Перенесите этот раствор в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 30 миллилитров раствора W5, и переверните трубку для смешивания. Центрифуга трубки на 51 г в течение шести минут.Используйте пипетку, чтобы аккуратно отказаться от этого супернатанта, не нарушая протопласты в гранулах. Добавьте 25 миллилитров раствора W5 и аккуратно повторно приостановите протопласты. Для стабилизации инкубировать в холодильнике по четыре по Цельсию в течение как минимум одного часа.После четырех градусов по Цельсию инкубации, гранулы протопласты полностью центрифугирования их на 46 г в течение двух минут. Аккуратно удалите супернатант полностью и добавьте раствор MANG в протопластовые гранулы, чтобы достичь пяти раз десять к шести на миллилитр. Используйте пипетку, чтобы добавить 10 микрограммов ДНК плазмы и 300 микролитров протопластового раствора в свежую 13-миллилитровую круглую нижнюю трубку.Смешайте, аккуратно вращая трубки вручную, а затем сразу добавьте 300 микролитров свежеприготовленного 40%PEG раствора. Смешайте полностью, наклоняя трубку почти горизонтально и вращая ее нежно несколько раз вручную. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.Затем добавьте один миллилитр раствора W5 и полностью перемешайте, аккуратно вращая трубку вручную, как и раньше. Инкубировать образец в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите еще два раза с добавлением сначала 1,5 миллилитров, а затем два миллилитров W5 и после окончательного добавления и смешивания, инкубировать в течение 30 минут.Центрифуга трубки на 46 г в течение четырех минут, а затем отказаться от супернатанта. Добавьте в гранулы два миллилитров раствора W5 и смешайте аккуратно, но полностью, так же, как и раньше. Инкубировать при 22 градусах по Цельсию в темной камере в течение 18 часов.Для анализа импорта белка с помощью микроскопии флуоресценции используйте пипетку с подстриженным наконечником, чтобы поместить 10 микролитров раствора протопласта на стеклянную горку. Используйте крышку скольжения тщательно покрыть решение, чтобы избежать повреждения протопластов. Поместите слайд на стадии флуоресцентного микроскопа с фильтром приема возбуждения, который устанавливается для наблюдения зеленого флуоресцентного белка и хлорофилла аутофторесценции.Используйте охлажденую камеру устройства для захвата изображений и обработки их с помощью программного обеспечения для редактирования изображений псевдоцвета. Для общего извлечения белка и иммуноблоттинга удалите один миллилитр из раствора протопласта и смешайте оставшийся миллилитр. Перенесите этот протопластический раствор в центрифугу и центрифугу при 46 г в течение четырех минут.Удалите супернатант после завершения центрифугации и добавьте 80 микролитров буфера денатурации. Вихрь энергично в течение пяти секунд. Добавьте пять буферов образца XDS, хорошо перемешайте и варите в течение 10 минут, чтобы денатуратура.Продолжить со стандартной страницей STS и иммуноблоттинга с анти-GFP антитела. RbcS и TGFT, термоядерная конструкция, кодирующей 79 конечных терминалов аминокислотных остатков РБКС, содержащих транзитный пептид, сплавленный в GFP, были использованы для изучения импорта белков в хлоропласты с помощью микроскопии флорескции и иммуноблоттинга. При осмотре микроскопией флорескции зеленые флуоресцентные сигналы от целевого белка слились с красными флуоресцентными сигналами от хлорофилла, указывающими на импорт белка в хлоропласты.После изоляции общего белка, две белковые полосы наблюдаются в иммуноблоте, показывая, что белок был правильно импортирован в хлоропласты. Верхняя полоса соответствует прекурсору полной длины и нижней полосе обработанной форме после импорта в хлоропласты. Количество обработанной формы белка увеличивается во времени зависимым образом, что позволяет предположить, что белок импортируется в хлоропласты.При этом развитии, этот метод проложил путь для исследователей в области клеточной биологии для изучения белка утомительно или мембраны нить сбора в Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...