Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Detta arbete genomfördes med stöd av Cooperative Research Program för jordbruk vetenskap och teknikutveckling (projekt nr. PJ010953012018), landsbygdens utveckling Administration och National Research Foundation (Korea) bidraget finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (nr 2016R1E1A1A02922014), Republiken Korea.

1. tillväxt av Arabidopsis växter
<ol><li>Förbereda 1 L Gamborg B5 (B5) medium genom att lägga till 3,2 g B5 medium inklusive vitaminer, 20 g sackaros, 0,5 g 2-(N-morpholino) etan sulfonsyra (MES) till cirka 800 mL avjoniserat vatten och justera pH till 5,7 med kaliumhydroxid (KOH). Lägg till mer avjoniserat vatten föra den totala volymen till 1 L. lägga till 8 g phytoagar och autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.</li>
	<li>Låt medlet att kyla ned till 55 ° C och häll 20 – 25 mL B5 mediet i en petriskål ...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Vi gav ett detaljerat protokoll för användning av protoplasts av Arabidopsis att studera protein import till kloroplaster. Denna metod är kraftfulla för att utreda protein importprocessen. Denna enkla, mångsidig teknik är användbar för att undersöka inriktningen av de avsedda Last proteinerna till kloroplaster. Med den här metoden är protoplasts beredda från leaf vävnader Arabidopsis11,12 som kan erhållas från växter i många oli...

Kloroplast är en av de viktigaste organeller i växter. En av de viktigaste funktionerna i kloroplaster är att utföra fotosyntes1. Kloroplaster utför också många andra biokemiska reaktioner för produktion av fettsyror, aminosyror, nukleotider och många sekundära metaboliter1,2. För alla dessa reaktioner kräver kloroplaster ett stort antal olika typer av proteiner. Kloroplast genomet innehåller dock endast cirka 100 gener3,4. Kloroplaster måste därför importera majoriteten av deras proteiner från cytosolen. I själva verket visades de flesta kloroplast proteiner importeras från cytosolen efter översättning4,5,6. Växtceller kräver särskilda mekanismer att importera proteiner från cytosolen till kloroplaster. Dock även om dessa protein import mekanismer har undersökts under de senaste decennierna, förstår vi fortfarande inte helt dem på molekylär nivå. Här ger vi en detaljerad metod för att förbereda protoplasts och exogent uttrycker gener i protoplasts. Denna metod kan vara värdefullt för att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom protein import till kloroplaster i detalj.
Protein import kan studeras med hjälp av många olika metoder. En av dessa metoder innebär användning av ett in vitro- protein import system7,8. Med detta synsätt, i vitro-översatta protein prekursorer inkuberas med renat kloroplaster i vitrooch protein import analyseras av SDS-PAGE följt av western blot analys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att varje steg av protein import i kloroplaster kan studeras i detalj. Således, denna metod har använts i stor utsträckning att definiera komponenterna av protein import molekylära maskineri och dissekera sekvensinformation för transitering peptider. Mer nyligen, en annan strategi som inbegriper användning av protoplasts från leaf vävnader har utvecklats och det har blivit allmänt används att studera protein import till kloroplaster9,10. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att protoplasts ger en cellulär miljö som är närmare intakta celler än det in vitro- systemet. Således tillåter det protoplast systemet oss att ta itu med många ytterligare aspekter av denna process, såsom associerade cytosoliska händelserna och hur specificitet riktade signaler bestäms. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för användning av protoplasts att studera protein import till kloroplaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Kloroplast är en grundläggande organell som ansvarar för olika cellulära processer i växter, såsom fotosyntes och produktionen av många sekundära metaboliter och lipider. Kloroplaster kräver ett stort antal proteiner för dessa olika fysiologiska processer. Över är 95% av kloroplast proteiner nucleus-kodade och importeras till kloroplaster från cytosolen efter översättning på cytosoliska ribosomer. Således är rätt import eller inriktning av dessa nucleus-kodade kloroplast proteiner till kloroplaster väsentliga för en väl fungerande kloroplaster liksom cellen växt. Nucleus-kodade kloroplast proteiner innehåller signal sekvenser för specifika inriktning till kloroplaster. Molekylära maskineri lokaliserade till kloroplast eller cytosol erkänna dessa signaler och utföra importen. För att undersöka mekanismer för protein import eller inriktning till kloroplaster i vivo, utvecklade vi en snabb, effektiv protoplast-baserad metod för att analysera protein import till kloroplaster av Arabidopsis. Den här metoden använder vi protoplasts isolerade från leaf vävnader i Arabidopsis. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för att använda protoplasts för att undersöka den mekanism genom vilken proteiner importeras till kloroplaster.

Import av proteiner till kloroplaster kan undersökas med hjälp av två metoder: fluorescence mikroskopi och immunoblot analys efter SDS-PAGE-medierad separation. Här, vi använde röda blodkroppar-nt:GFP, en fusion konstruera kodning 79 N-terminala aminosyran resthalter av röda blodkroppar som innehåller transit peptiden smält till GFP. När proteiner importeras till kloroplaster, grön fluorescens signaler från målproteinet RBC-nt:GFP skulle slås samman med röd fluorescerande s...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Här beskriver vi ett protokoll för att uttrycka proteiner i protoplasts genom att använda PEG-medierad omvandling metod. Metoden ger lätt uttryck av proteiner av intresse och effektiv utredning av protein lokalisering och importprocessen för olika experimentella förhållanden invivo.

Studera Protein Import till kloroplaster som använder Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Detta mysterium kan hjälpa till att svara på några frågor inom cellbiologi såsom proteintillförsel till kloroplaster. Den största fördelen med denna teknik är att proteintillförsel till kloroplaster kan studeras under en vivo-förhållanden. Demonstrera förfarandet kommer att Junho Lee och Hyangju Kang, två post outs från mitt laboratorium.Till att börja skörda intakta bladvävnader från två veckor gamla växter från en till två B5-plattor. Använd en kirurgisk kniv för att skörda bladen och placera dem i en 50 milliliter konisk slang som innehåller 25 milliliter enzymlösning. Placera röret horisontellt på en roterande skakmaskin och inkubera med mild agitation i 22 grader Celsius i mörker i åtta till 12 timmar tills endast petioler och stjälkar finns kvar i lösningen.Efter avslutad inkubation, filtrera enzymlösningen som innehåller frisläppta protoplaster genom ett nät i 140 mikrometer porstorlek till en färsk Petriskål. Sedan försiktigt lager lösningen ovanpå 15 milliliter 21%sackaros lösning i en 50 milliliter konisk slang. Centrifugera röret i en svängande bucket rotor vid 98 gs i 10 minuter med de lägsta acceleration och retardation inställningar.Därefter använder paturapipett för att försiktigt avlägsna protoplasterna från det översta skiktet som innehåller enzymlösning och från gränssnittet mellan enzymerlösningen och sackaroslösningen. Överför denna lösning till ett koniskt rör på 50 milliliter som innehåller 30 milliliter W5-lösning och inverterar röret för att blanda. Centrifugera röret vid 51 gs i sex minuter.Använd en pipett för att kassera denna supernatant försiktigt utan att störa protoplasterna i pelleten. Tillsätt 25 milliliter W5-lösning och försiktigt åter upphäva protoplasterna. För stabilisering, inkubera i en fyra Celsius kylskåp i minst en timme.Efter fyra grader Celsius inkubation, pellet protoplasterna helt genom centrifugering dem på 46 gs i två minuter. Ta försiktigt bort supernatenten helt och tillsätt MANG-lösning i protoplastpellet för att uppnå fem gånger tio till sex per milliliter. Använd en pipettering för att lägga till 10 mikrogram av plasma-DNA och 300 mikroliter protoplastlösning till ett färskt 13 milliliter runt bottnat rör.Blanda genom att försiktigt rotera rören för hand och tillsätt sedan omedelbart 300 mikroliter av nyberedd 40%PEG-lösning. Blanda helt genom att luta röret nästan horisontellt och rotera den skonsam flera gånger för hand. Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.Tillsätt sedan en milliliter W5-lösning och blanda helt genom att försiktigt rotera röret för hand som tidigare. Inkubera provet i 10 minuter i rumstemperatur. Upprepa ytterligare två gånger med att lägga till första 1,5 milliliter och sedan två milliliter W5 och efter det slutliga tillägg och blandning, inkubera i 30 minuter.Centrifugera röret vid 46 gs i fyra minuter och kassera sedan supernatanten. Tillsätt två milliliter W5-lösning till pelleten och blanda försiktigt, men helt, på samma sätt som tidigare. Inkubera vid 22 grader Celsius i en mörk kammare i 18 timmar.För att analysera proteinimporten med hjälp av florescencemikroskopi, använd en pipett med trimmad spets för att placera 10 mikroliter av protoplastlösningen på en glasrutschbana. Använd en täcksli för att noga täcka lösningen för att undvika att skada protoplasterna. Placera bilden på scenen i ett fluorescensmikroskop med en excitation antagning filter som är inställd för att observera gröna fluorescerande protein och klorofyll autofluorescens.Använd en kyld laddning par enhet kamera för att fånga bilder och bearbeta dem med hjälp av en föreställa redigeringsprogram för att producera pseudo-färg bilder. För total proteinutsug och immunoblotting, avlägsna en milliliter från protoplastlösningen och blanda resterande en milliliter. Överför denna protoplastlösning till ett centrifugrör och centrifug vid 46 gs i fyra minuter.Ta bort supernatanten efter avslutad centrifugering och tillsätt 80 mikroliter av denaturationsbuffert. Virvel vigoriously i fem sekunder. Tillsätt fem XDS provbuffert, blanda väl och koka i 10 minuter till denature.Fortsätt med standard STS sida och immunoblotting med anti-GFP antikropp. RbcS och TGFT, en fusion konstruera kodning de 79 slutet terminal aminosyra rester av RBCS som innehåller transitering peptid smält till GFP, användes för att studera import av proteiner till kloroplaster genom florescence mikroskopi och immunoblotting. Vid granskning av florescencemikroskopi, gröna fluorescerande signaler från målproteinet samman med de röda fluorescerande signalerna från klorofyll autoflorescence som indikerar proteinimport till kloroplaster.Efter att ha isolerat totalt protein observeras två proteinband i immunoblot, vilket visar att ett protein importerades korrekt till kloroplaster. Det övre bandet motsvarar den fullständiga längden föregångare och det nedre bandet till den bearbetade formen efter import till kloroplaster. Mängden av proteinformens bearbetade form ökade på ett tidsberoende sätt, vilket tyder på att proteinet importeras till kloroplaster.Vid denna utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom cellbiologi att utforska protein tröttande eller membran tråd plockning i Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...