Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.

1. Arabidopsis bitkilerin büyüme
<ol><li>1 L Gamborg B5 hazırlamak B5 orta 3.2 g ekleyerek (B5) orta vitaminler, 20 g sükroz, yaklaşık 800 ml deiyonize su 2-(N-morpholino) etan sülfonik asit (MES) 0.5 g de dahil olmak üzere ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Ekle daha deiyonize su getir toplam hacim 1 L. eklemek 8 g phytoagar ve otoklav 121 ° C'de 15 dakika için</li>
	<li>Aşağı 55 ° C serin ve temiz bir Bank, Petri kabına (9 cm çapında, yüksekliği 1,5 cm) içine B5 orta 20 – 2...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11...

Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri4,5,6sonra alınmak üzere gösterilmiştir. Bitki hücreleri proteinler sitozol kloroplast için almak için belirli mekanizmaları gerektirir. Her ne kadar son birkaç yıldır bu protein alma mekanizmaları araştırdık, ancak, biz hala tam olarak onları moleküler düzeyde anlamıyorum. Burada, biz önceki hazırlanması ve exogenously önceki genlerinde ifade için detaylı bir yöntem sağlar. Bu yöntem protein alma kloroplast ayrıntılı içine temel moleküler mekanizmaları elucidating için değerli olabilir.
Protein alma birçok farklı yaklaşımlar kullanarak okudu olabilir. Bu yöntemlerden birini vitro protein alma sistem7,8kullanımını gerektirir. Bu yaklaşım, vitro-çevrilmiş protein öncüleri arıtılmış kloroplast vitroile inkübe ve protein alma tarafından SDS-sayfası western blot Analizi tarafından takip analiz edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı olduğunu protein alma her adım kloroplast içine ayrıntılı olarak incelenecektir. Bu nedenle, bu yöntem yaygın protein alma moleküler makine bileşenleri tanımlamak için ve sırası bilgi için transit peptidler incelemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, başka bir yaklaşım önceki yaprak dokuları üzerinden kullanımını içeren geliştirilmiş ve yaygın olarak protein alma kloroplast9,10içine eğitim için kullanılır hale. Bu yaklaşımın avantajı önceki vitro sistemi daha sağlam hücreleri olan yakın bir hücresel ortamı sağlamaktır. Böylece, protoplast sistem bize bu işlem, ilişkili sitozolik olaylar ve sinyalleri hedefleme özgüllüğü belirleme gibi birçok ek yönlerini ele sağlar. Burada, protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya önceki kullanımı için detaylı bir protokol mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95'i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.

İçe aktarma işlemi proteinlerin kloroplast iki yaklaşım kullanılarak incelenebilir: floresans mikroskobu ve immunoblot analizden sonra SDS-sayfa-aracılı ayırma. Burada, biz RbcS kullanılır-nt:GFP, bir füzyon oluşturmak için GFP erimiş transit peptid içeren RbcS 79 N-terminal amino asit kalıntıları kodlama. Proteinler kloroplast alındığında, yeşil floresans hedef protein RbcS sinyalleri-nt:GFP birleştirme ile klorofil auto-floresan, gelen kırmızı floresan sinyal...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Bu gizem, hücre biyolojisi alanında protein input gibi birkaç soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknolojinin en büyük avantajı, en vivo koşullarda kloroplastlara protein girişinin çalışılmasıdır. Prosedürü gösteren Junho Lee ve Hyangju Kang, benim laboratuvar dan iki sonrası outs olacaktır.Başlamak için, bir ila iki B5 plakaları iki haftalık bitkilerden bozulmamış yaprak dokuları hasat. Yaprakları hasat ve enzim çözeltisi 25 mililitre içeren 50 mililitrekonik tüp içine yerleştirmek için bir cerrahi bıçak kullanın. Tüpü yatay olarak döner bir çalkalayıcıüzerine yerleştirin ve 22 santigrat derecede hafif bir ajitasyonla karanlıkta sadece petioles ve sapları çözeltide kalana kadar 8 ila 12 saat boyunca inkübe edin.Kuluçkayı tamamladıktan sonra, serbest bırakılan protoplastları içeren enzim çözeltisini 140 mikrometrelik gözenek büyüklüğündeki örgüden taze bir Petri kabına süzün. Daha sonra çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpte %21 sakaroz çözeltisinin 15 mililitre üzerine dikkatlice katlayın. En düşük hızlanma ve yavaşlama ayarları ile 10 dakika boyunca 98 gs bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.Bundan sonra, enzim çözeltisi içeren en üst tabakadan ve enzim solüsyonu ile sakkaroz çözeltisi arasındaki arabirimden protoplastları dikkatlice çıkarmak için patura pipetini kullanın. Bu çözeltiyi 30 mililitre W5 çözeltisi içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü karıştırmak için ters çevirin. Tüpü 51 gs'de altı dakika santrifüj edin.Peletteki protoplastları rahatsız etmeden bu süpernatantı dikkatlice atmak için bir pipet kullanın. 25 mililitre W5 çözeltisi ekleyin ve protoplastları nazikçe yeniden askıya alın. Stabilizasyon için, en az bir saat boyunca dört santigrat buzdolabında kuluçka.Dört derece santigrat kuluçka sonra, pelet tamamen iki dakika için 46 gs onları santrifüj ederek protoplasts. Supernatent'i dikkatlice tamamen çıkarın ve mililitre başına altıya beş kat on elde etmek için protoplast peletine MANG çözeltisi ekleyin. Taze 13 mililitrelik yuvarlak dipli tüpe 10 mikrogram plazma DNA'sı ve 300 mikrolitre protoplast çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın.Tüpleri elle hafifçe döndürerek karıştırın ve hemen 300 mikrolitre taze hazırlanmış %40 PEG çözeltisi ekleyin. Tüpü neredeyse yatay olarak yatırarak ve birkaç kez elle hafifçe döndürerek tamamen karıştırın. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.Sonra W5 çözeltisi bir mililitre ekleyin ve daha önce olduğu gibi yavaşça elle tüp döndürerek tamamen karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. İlk 1,5 mililitre ve daha sonra w5 iki mililitre ekleyerek ve son ekleme ve karıştırma sonra, 30 dakika kuluçka ile iki kez daha tekrarlayın.Dört dakika boyunca 46 gs tüp santrifüj ve sonra supernatant atın. Pelet iki mililitre W5 çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın, ama tamamen, daha önce olduğu gibi aynı şekilde. Karanlık bir odada 22 derecede 18 saat kuluçkaya yat.Floresan mikroskobu kullanarak protein ithalatıanaliz etmek için, bir cam slayt üzerine protoplast çözeltisi 10 mikrolitre yerleştirmek için kesilmiş ucu ile bir pipet kullanın. Protoplastlara zarar vermemek için çözeltiyi dikkatlice örtmek için bir kapak fişi kullanın. Yeşil floresan protein ve klorofil otofloresan gözlemlemek için ayarlanmış bir uyarma kabul filtresi ile bir floresan mikroskop sahnesine slayt yerleştirin.Görüntüleri yakalamak ve sözde renkli görüntüler üretmek için bir hayal düzenleme yazılımı kullanarak bunları işlemek için soğutulmuş şarj çift cihaz kamera kullanın. Toplam protein çıkarma ve immünoblotting için, protoplast çözeltisinden bir mililitre çıkarın ve kalan bir mililitre karıştırın. Bu protoplast çözeltiyi 46 gs'de dört dakika boyunca bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.Santrifüj tamamladıktan sonra supernatant çıkarın ve denatürasyon tampon 80 mikrolitre ekleyin. Girdap beş saniye boyunca güçlü bir şekilde. Beş XDS örnek tampon ekleyin, iyice karıştırın ve dennature için 10 dakika kaynatın.Standart STS sayfası ve anti-GFP antikor ile immünoblot ile devam edin. RBCS ve TGFT, GFP'ye kaynaşmış transit peptid içeren RBCS'nin 79 son terminal amino asit kalıntılarını kodlayan bir füzyon yapısı olan floresan mikroskobu ve immünoblotlama ile proteinlerin kloroplastlara ithalatını incelemek için kullanılmıştır. Floresan mikroskobu ile incelendiğinde, hedef proteinden gelen yeşil floresan sinyaller klorofil otofloresanstan gelen kırmızı floresan sinyallerle birleşerek kloroplastlara protein ithal ettiğini gösterir.Toplam protein izole edildikten sonra, iki protein bantları immünoblot gözlenir, bir protein düzgün kloroplast içine ithal olduğunu gösteren. Üst bant kloroplastiçine ithal edildikten sonra işlenmiş forma tam uzunlukta öncül ve alt bant karşılık gelir. Proteinin işlenmiş form miktarı zamana bağlı bir şekilde artarak proteinin kloroplastlara ithal edildiğini düşündürmektedir.Bu gelişmede, bu teknik, hücre biyolojisi alanında araştırmacıların Arabidopsis'te protein yorucu veya membran iplik toplamayı keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...