Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
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1. 阳离子纳米脂质体的产生 (图 1)
<ol><li>溶解脂质 dc-胆固醇 (3β-[n-(n ', n '-二甲基氨基乙烷)-氨基乙酰] 盐酸胆固醇) 和 dope (二烯醇磷脂酰乙醇胺), 以氯仿的形式提供, 最终浓度为 25 mg/ml。 注: 将溶解的脂质存放在-20°c。</li>
	<li>使用 25 mgml 两种脂类的库存解决方案。将溶解的 dc 胆固醇的40μl 和溶解的 dope 的80μl 混合在一个玻璃瓶中。 注: 总脂量为3毫克。为避免氯仿快速...

该协议描述了具有高封装效果的 nlps 的生成, 以合成改性 mrna, 以及细胞在体外的可靠转染。此外, nlps 保证 mrna 的释放, 而 mrna 又被转化为细胞内的功能蛋白。此外, 使用 nlps 的转染可以在常规细胞培养基中进行, 从而在转染过程中产生较高的细胞振动, 并在转染后最多持续三天。
使用 mrna 作为治疗, 自组装系统为其交付的首选。最常见的转染试剂包括阳离子脂质, 包括脂?...

在过去几年中, 改性 mrna 在治疗应用中的应用显示出巨大的潜力。在心血管、炎症和单基因疾病以及疫苗开发中, mrna 是一种很有前途的治疗药物1。
蛋白质替换疗法与 mrna 提供了几个好处比古典基因疗法, 根据脱氧核糖核酸转染入目标细胞2。mrna 功能直接在细胞溶胶中启动。尽管质粒 dna (pdna) 是一种双链结构, 含有启动子区域的圆形 dna 和编码治疗蛋白3的基因序列, 也在细胞溶胶中发挥作用, 但它只能被纳入正在进行有丝分裂的细胞中在转染的时候。这减少了组织中转染的细胞数量 1,4。具体来说, 有丝分裂活性弱的组织, 如心肌细胞的转染是困难的 5。与 pdna 不同的是, mrna 的转染和转化发生在组织1,6的有丝分裂和非有丝分裂细胞中。dna 与宿主基因组的病毒整合可能伴随着致突变效应或免疫反应7,8, 但在细胞转染后与蛋白质编码 mrna, 去重新合成所需的蛋白质自主开始 9,10。此外, 蛋白质合成可以通过单独剂量精确地调整到患者的需要, 而不会干扰基因组, 并有致突变效应11的危险.用伪尿素和 5 '-甲基胞苷代替尿素和胞苷12可显著降低合成生成的 mrna 的免疫激活潜力.假尿碱修饰的 mrna 也被证明具有更高的生物稳定性和显著提高的翻译能力13。
为了能够从基于 mrna 的治疗在临床应用中的有希望的特性中受益, 必须为 mrna 输送到细胞创造一个合适的工具。该飞行器应在体外和体内具有无毒特性, 保护 mrna 免受核酸酶降解的影响, 并提供足够的细胞吸收, 以便长时间地提供和翻译 mrna14。
在所有可能的体内药物传递载体类型中, 如碳纳米管、量子点和脂质体, 后者的研究最多 15、1 6.脂质体是由脂质双层10组成的囊泡。它们是具有疏水性和亲水性的两亲性, 通过这些分子的自排列, 形成了一个球形的双层。在脂质体内, 治疗药物或药物可以被封装, 从而防止酶降解 18.含有 n-[1, 2, 3-二烯二氧基) 丙基]-n 的脂质体, n、n-三甲基氯化铵 (dadma)19、[1, 2-bis (oley合 y)-3-(三甲基氨)丙烷] (dadap) 20 和二辛烷基氨基氨基氨基氨基氨基氨基胺胺 (dogs)21, 或dc-胆固醇22, 有很好的特征, 经常用于与 dna 或 rna 的细胞转染。
阳离子脂质体包括带正电荷的脂质和未带电的磷脂 23。通过阳离子脂质体转染是将核酸输送到细胞24,25的最常用方法之一。在核酸分子的主干中, 阳离子脂质颗粒与负电荷磷酸盐基团形成复合物26。这些所谓的脂质附着物附着在细胞膜表面, 并通过内吞或内皮样机制进入细胞 27。
1989年, 马龙等人。成功地描述了阳离子脂介导的mrna 转染28。然而, 使用 dotma 和 1, 2-二醇-sn-h神菌-3-磷乙醇胺 (dope) 的混合物, 该组发现 dotma 表现出细胞毒性作用28。此外, zohra等人还表明, dadap (1, 2-二烯二氧基 3-三甲基丙烷氯丙烷) 可用作 mrna 转染试剂29。然而, 为了有效转染细胞, dopap 应与其他试剂结合使用, 如纤维连接蛋白 29或 dope30。到目前为止, d同甲是市场上第一个用于基因传递的阳离子脂质 31.其他脂类被用作治疗载体或正在临床试验的不同阶段进行检测 (例如, 含有 dentap 作为脂质载体的 endatg-i) 目前正在第二阶段临床试验32中进行调查。
这项工作描述了一个协议, 用于生成含有 dc 胆固醇和 dope 的 nlps。此方法易于执行, 并允许生成不同大小的 nlps。使用干膜法生成 nlp 的总体目标是为 mrna 络合创建脂质体, 从而允许在体外高效和生物相容性的细胞转染 14,33。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

由于体外转录 (ivt) mrna 的积极特性, 基于信使 rna (mrna) 的治疗各种疾病的疗法的开发变得越来越重要。在 ivt mrna 的帮助下, 可以在不改变目标细胞生理状态的情况下诱导所需蛋白质的新合成。此外, 由于 ivt mrna 的瞬态效应, 可以精确地控制蛋白质的生物合成。
对于细胞的有效转染, 纳米脂质体 (nlps) 可能是治疗 mrna 的安全有效的载体。本研究描述了一种生成安全高效阳离子 nlps 的协议, 该方案由 dc-胆固醇和 1, 2-二醇-环甘油酯-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------nlps 具有定义的尺寸、均匀分布和较高的复用能力, 可使用干膜法生产。此外, 我们提出了不同的测试系统, 以分析他们的络合和转染效率使用合成增强绿色荧光蛋白 (transfection) mrna, 以及他们对细胞活力的影响。总体而言, 所提出的协议为 mrna 络合提供了一种有效和安全的方法, 可以促进和改进治疗性 mrna 的管理。

利用该协议, 采用干膜法制备了由脂质 dc-胆固醇和 dope 组成的 nlps (图 1)。在制备过程中, 纳米脂质体溶液显示浊度的不同阶段 (图 2)。
然后, 通过使用 rna 定量试剂盒 (图3) 分析未封装的 mrna 的自由量, 可以分析 nlps 的封装效果。
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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

阳离子纳米脂质体的生成, 用于高效输送体外转录信使 rna

在这里, 我们描述了一个方案的阳离子纳米脂质体的生成, 这是基于干膜法, 并可用于安全和有效的传递体外转录信使 rna。

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

该协议允许生产安全高效的纳米脂质体，可用作治疗信使RNA的转染工具。这些纳米利波体促进mRNA吸收细胞，从而增加蛋白质表达水平，而不影响细胞的生存能力。该技术的主要优点是快速、轻松地生成具有明确尺寸和均匀分布的稳定纳米脂质体。此外，它们保护封装的 mRNA 免受降解，并导致长时间的翻译。演示这个程序的将是安东尼娅·林克，一个来自我们实验室的博士生。为了开始这个程序，准备脂质，DC胆固醇和兴奋剂的库存解决方案，通过溶解每一个氯仿到每毫升25毫克的最终浓度。将溶解的直流胆固醇的40微升与80微升的溶解掺杂剂混合在玻璃瓶中。在气流下蒸发氯仿15分钟。接下来，用硅胶填充干燥器。将打开的玻璃瓶放在里面，并隔夜吸尘，以确保剩余的氯仿蒸发。由此产生的脂质膜将形成在玻璃瓶内。第二天，加入一毫升无核酸酶水，以补充脂质膜的水分。和漩涡暂停15分钟。将悬架放入声波浴中一小时。在此之后，根据制造商的说明组装迷你挤出机。用液体悬浮液填充注射器，并放在挤出机的一侧。将空注射器放在另一侧。将脂质悬浮液通过膜从一个注射器压到另一个注射器，大约 20-25 次以挤出悬浮液。然后，将纳米脂质在四摄氏度的玻璃瓶中储存，直到准备好使用。首先，在冰上解冻合成mRNA。在打开管子前不久旋转冷冻的mRNA，然后离心。然后，将合成mRNA的一微克与不同量的纳米脂体悬浮液混合。在室温下短暂离心并孵育20分钟，用于纳米复位形成。然后，将普通细胞介质的毫升添加到纳米立体中，然后通过上下移液混合。转染前一天准备细胞。因此，板15万个 A549 细胞进入每个井的12井板前一天转染。用5%的二氧化碳和常规细胞培养基在37摄氏度下孵育细胞24小时。第二天，用一毫升PBS清洗每个准备好的细胞。将一毫升准备好的纳米复利混合物加入其中一个含有 A549 细胞的井中。在常规条件下孵育24小时，分析转染效率，或24-72小时分析转染后细胞的生存能力。取出上一杯，用一毫升PBS清洗每一个井，以去除剩余的纳米脂质。为了准备细胞进行细胞学，首先将500微升的三辛EDTA添加到每个井中，并在37摄氏度下孵育3分钟，以尝试细胞的辛酸化。接下来，添加 500 微升的常规 FBS 介质，以停止该过程并停用 trypsin。将细胞在400倍G下离心5分钟。并小心去除上一提液，而不干扰细胞颗粒。用一毫升PBS清洗细胞。然后将细胞重新悬浮在300微升细胞固定溶液中，并将它们转移到流动的细胞学管中。使用流量环测仪分析488纳米的细胞。要准备荧光显微镜的细胞，在每口井中加入一毫升的冰镇甲醇来修复细胞。将溶解在PBS中的300纳米摩尔溶液的500微升添加到每一个井中。在黑暗中孵育五分钟。在此之后，取出DAPI溶液，再次用以前储存在零下20摄氏度的100%甲醇清洗细胞。使用荧光显微镜使用此处所示的激发和发射波长分析细胞。在这项研究中，纳米脂质体产生具有合成改性mRNA的高封装功效。利用RNA定量试剂盒，通过分析未封装的mRNA的可用量，在封装1微克eGFP编码mRNA后，可以分析纳米脂质体的封装功效。EGFP mRNA封装在不同数量的纳米脂质中后，形成纳米复性可以在体外用细胞孵育，并且可以通过流式细胞切除术24小时后分析eGFP表达细胞的百分比。如这里看到，即使只有一微升的纳米脂质体溶液也足以实现细胞内感染的高转染。当细胞与含有Cy3标记的eGFP mRNA的纳米利波体进行转染时，可以可视化细胞质中eGFP mRNA的存在以及已经产生的eGFP蛋白。由于使用纳米复位细胞的转染会对细胞产生不良影响，因此在转染后24小时和72小时测试细胞的生存能力。当用2.5或5微升的纳米复用处理细胞时，对细胞的生存能力没有影响。在尝试此过程时，必须记住在无乙醇环境中一直工作，因为这可能会损害纳米脂体稳定性。在准备和混合DC胆固醇与兴奋剂时，您应该使用玻璃移液器，以避免溶解脂质与塑料移液器尖端的可溶性成分污染。按照此协议，在制备过程中或之后，可以轻松操作生成的纳米脂质。例如，PEG分子或特异性抗体的加入会导致稳定性提高或启动活性组织靶向。生成的纳米利波索体满足必要的安全方面，并促进mRNA吸收到目标细胞。纳米利波体与特定治疗nRNA复合，可以作出重要贡献，以开发新的mRNA为基础的治疗领域组织工程或替代疗法，例如。

Research

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