Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
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1. Cationic Nanoliposomes की जनरेशन (चित्रा 1)
<ol><li>लिपिड डीसी भंग-कोलेस्ट्रॉल (3β-[n-(n ′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] कोलेस्ट्रॉल हाइडरोक्लॉराइड) और डोप (dioleoyl phosphatidylethanolamine), एक पाउडर के रूप में दिया, क्लोरोफॉर्म में एक अंतिम एकाग्रत?...

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक संशोधित mRNA के लिए उच्च encapsulation प्रभावकारिता के साथ NLps की पीढ़ी का वर्णन, साथ ही साथ इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विश्वसनीय अभिकर्मक. इसके अलावा, NLps mRNA, जो बारी में, कोशिकाओं के अंद?...

चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संशोधित mRNA के उपयोग के पिछले कुछ वर्षों में महान क्षमता दिखाया गया है । हृदय, भड़काऊ, और monogenetic रोगों, साथ ही टीके के विकास में, mRNA एक होनहार चिकित्सकीय एजेंट1है ।
mRNA के साथ प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी शास्त्रीय जीन थेरेपी, जो लक्ष्य कोशिकाओं2में डीएनए अभिकर्मक पर आधारित है पर कई लाभ प्रदान करता है । mRNA फ़ंक्शन सीधे cytosol में प्रारंभ करता है । हालांकि प्लाज्मिड डीएनए (pDNA), एक प्रमोटर क्षेत्र और चिकित्सीय प्रोटीन3एंकोडिंग एक जीन अनुक्रम युक्त दोहरे-असहाय, परिपत्र डीएनए का निर्माण, यह भी cytosol में कार्य करता है, यह केवल कोशिकाओं में शामिल किया जा सकता है जो बँटवारा के माध्यम से जा रहे हैं के समय अभिकर्मक । यह ऊतक1,4में transfected कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है । विशेष रूप से, हृदय कोशिकाओं के रूप में कमजोर बँटवारा गतिविधि के साथ ऊतकों की अभिकर्मक, मुश्किल है5. pDNA के विपरीत, ऊतक1,6में mitotic और गैर mitotic कोशिकाओं में mRNA के अभिकर्मक और अनुवाद होते हैं । डीएनए के वायरल एकीकरण मेजबान जीनोम में mutagenic प्रभाव या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ आ सकता है7,8, लेकिन एक प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद mRNA एन्कोडिंग, वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण 9,10autonomously शुरू होता है । इसके अलावा, प्रोटीन संश्लेषण ठीक व्यक्तिगत खुराक के माध्यम से रोगी की जरूरत के लिए समायोजित किया जा सकता, जीनोम के साथ हस्तक्षेप के बिना और mutagenic प्रभाव11खतरे में डाल. सिंथेटिक जनित mRNA की प्रतिरक्षा सक्रिय क्षमता नाटकीय रूप से छद्म uridine और 5 '-methylcytidine के बजाय uridine और cytidine12का उपयोग करके कम किया जा सकता है । छद्म uridine संशोधित mRNA भी एक वृद्धि हुई जैविक स्थिरता और एक काफी उच्च अनुवाद क्षमता13दिखाया गया है ।
नैदानिक अनुप्रयोगों में mRNA आधारित चिकित्सा के होनहार गुणों से लाभ के लिए सक्षम होने के लिए, यह सेल में mRNA के परिवहन के लिए एक उपयुक्त वाहन बनाने के लिए आवश्यक है । इस वाहन को इन विट्रो में और vivoमें गैर विषैले गुण सहन करना चाहिए, nuclease-क्षरण के खिलाफ mRNA की रक्षा, और एक लंबे समय तक उपलब्धता और mRNA14के अनुवाद के लिए पर्याप्त सेलुलर प्रदान करते हैं ।
इस तरह के कार्बन नैनोट्यूब, क्वांटम डॉट्स, और liposomes के रूप में vivo दवा वितरण में के लिए सभी संभव वाहक प्रकार, के अलावा सबसे अधिक15,16का अध्ययन किया गया है । Liposomes एक लिपिड bilayer10से मिलकर बुलबुले हैं । वे एक hydrophobic और एक हाइड्रोफिलिक धारा के साथ amphiphilic हैं, और इन अणुओं की आत्म व्यवस्था के माध्यम से, एक गोलाकार डबल परत17बनाई गई है । liposomes के अंदर, चिकित्सीय एजेंटों या दवाओं और समझाया जा सकता है, इस प्रकार, एंजाइमी गिरावट18से संरक्षित । Liposomes युक्त n-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-n, n, n-trimethylammonium क्लोराइड (DOTMA)19, [1, 2-भा (oleoyloxy)-3-(trimethylammonio) प्रोपेन] (DOTAP)20, और dioctadecylamidoglycylspermine (कुत्ते)21, या डीसी-कोलेस्ट्रॉल22, अच्छी तरह से विशेषता और अक्सर डीएनए या आरएनए के साथ सेलुलर अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।
Cationic liposomes एक सकारात्मक आरोप लगाया लिपिड और एक unchargeed फॉस्फोलिपिड23शामिल हैं । अभिकर्मक via cationic liposomes24,25कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड के परिवहन के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है । cationic लिपिड कणों न्यूक्लिक एसिड अणुओं की रीढ़26में नकारात्मक आरोप फॉस्फेट समूहों के साथ परिसरों के रूप में । ये तथाकथित lipoplexes कोशिका झिल्ली की सतह के लिए संलग्न है और endocytosis या endocytosis के माध्यम से सेल दर्ज करें-जैसे तंत्र27।
१९८९ में, मेलोन एट अल. सफलतापूर्वक वर्णित cationic लिपिड मध्यस्थता mRNA अभिकर्मक28. हालांकि, DOTMA और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) के मिश्रण का उपयोग करते हुए, समूह ने पाया कि DOTMA अमानत साइटोटोक्सिक प्रभाव28. साथ ही, ज़ोहरा एट अल. दिखाया गया है कि DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-प्रोपेन क्लोराइड) एक mRNA अभिकर्मक29एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, DOTAP अन्य रिएजेंट के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जैसे fibronectin29 या डोप30. अब तक DOTMA का जीन डिलिवरी31के लिए इस्तेमाल होने वाला बाजार पर पहला cationic लिपिड था । अन्य लिपिड चिकित्सीय वाहक के रूप में उपयोग किया जाता है या नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में परीक्षण किया जा रहा है, (जैसे, EndoTAG-I, एक लिपिड वाहक के रूप में DOTAP युक्त), वर्तमान में एक चरण द्वितीय नैदानिक परीक्षण३२में जांच की जा रही है.
यह काम डीसी युक्त NLps की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-कोलेस्ट्रॉल और डोप । इस विधि से प्रदर्शन करने के लिए आसान है और विभिंन आकारों की NLps की पीढ़ी की अनुमति देता है । एनएलपी पीढ़ी के सामांय लक्ष्य शुष्क फिल्म विधि का उपयोग करने के लिए mRNA रंग के लिए liposomes बना है, इस प्रकार की अनुमति कुशल और अभिकर्मक इन विट्रो मेंसंगत सेल14,३३।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

विभिन्न रोगों के उपचार के लिए दूत आरएनए (mRNA) आधारित चिकित्सीय चिकित्सा के विकास में अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है क्योंकि इन विट्रो प्रतिलिखित (IVT) mRNA के सकारात्मक गुणों की. IVT mRNA की मदद के साथ, एक वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण लक्ष्य कोशिका की शारीरिक स्थिति को बदलने के बिना प्रेरित किया जा सकता है । इसके अलावा, IVT mRNA के परिवर्तनीय प्रभाव के कारण प्रोटीन का संश्लेषण ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है ।
कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, nanoliposomes (NLps) चिकित्सीय mRNA के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रसव वाहन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इस अध्ययन के एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सुरक्षित और कुशल cationic उत्पंन NLps डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) IVT mRNA के लिए एक प्रसव के लिए सदिश के रूप में । NLps एक निर्धारित आकार, एक सजातीय वितरण, और एक उच्च रंग क्षमता है, और शुष्क फिल्म विधि का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है । इसके अलावा, हम विभिंन परीक्षण प्रणालियों वर्तमान के लिए उनके रंग और अभिकर्मक सिंथेटिक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) mRNA, साथ ही साथ सेल व्यवहार्यता पर अपने प्रभाव का उपयोग efficacies का विश्लेषण । कुल मिलाकर, प्रस्तुत प्रोटोकॉल mRNA परिसर के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित दृष्टिकोण है, जो अग्रिम और चिकित्सीय mRNA के प्रशासन में सुधार कर सकते है प्रदान करता है ।

वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का प्रयोग, लिपिड डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और डोप शुष्क फिल्म विधि (चित्रा 1) का उपयोग कर तैयार किया गया NLps । तैयारी के दौरान, nanoliposome समाधान turbidity (चि...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

के कुशल वितरण के लिए Cationic Nanoliposomes की जनरेशन इन विट्रो प्रतिलिखित दूत आरएनए

यहाँ हम cationic nanoliposomes की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो शुष्क फिल्म पद्धति पर आधारित है और इन विट्रो में के सुरक्षित और कुशल वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

यह प्रोटोकॉल सुरक्षित और कुशल नैनोलिपोमों के उत्पादन की अनुमति देता है जिसका उपयोग चिकित्सीय मैसेंजर आरएनए के लिए ट्रांसफैक्शन वाहनों के रूप में किया जा सकता है। ये नैनोलिपोम कोशिकाओं में एमआरएनए तेज की सुविधा प्रदान करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ जाता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ परिभाषित आकार और समरूप वितरण के साथ स्थिर नैनोलिपोस की तेज और आसान पीढ़ी है।इसके अलावा, वे समझाया mRNA गिरावट से बचाने के लिए और लंबे समय तक अनुवाद करने के लिए सीसा । प्रक्रिया का प्रदर्शन एंटोनिया लिंक, हमारी प्रयोगशाला से एक पीएचडी छात्र होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, क्लोरोफॉर्म में प्रत्येक को 25 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए भंग करके लिपिड, डीसी-कोलेस्ट्रॉल और डोप के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें।घुले डीसी-कोलेस्ट्रॉल के 40 माइक्रोलीटर मिलाएं एक ग्लास फ्लास्क में घुलित डोप के 80 माइक्रोलीटर के साथ। 15 मिनट के लिए एक आर्गन गैस प्रवाह के तहत क्लोरोफॉर्म वाष्पित करें। इसके बाद, सिलिका जेल के साथ एक डिसिकेटर भरें।खुले कांच के फ्लास्क को अंदर रखें और यह सुनिश्चित करने के लिए रात भर वैक्यूम लागू करें कि शेष क्लोरोफॉर्म सुखाया गया है। परिणामस्वरूप लिपिड फिल्म ग्लास फ्लास्क के अंदर बनेगी। अगले दिन, लिपिड फिल्म को फिर से हाइड्रेट करने के लिए नाभिक मुक्त पानी का एक मिलीलीटर जोड़ें।और 15 मिनट के लिए निलंबन भंवर । निलंबन को एक घंटे के लिए एक सोनीशन स्नान में रखें। इसके बाद, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार मिनी एक्सट्रूडर को इकट्ठा करें।तरल निलंबन के साथ एक सिरिंज भरें और इसे एक्सट्रूडर के एक तरफ रखें। एक खाली सिरिंज को दूसरी तरफ रखें। निलंबन को बाहर निकालने के लिए एक सिरिंज से दूसरे में झिल्ली के माध्यम से लिपिड निलंबन दबाएं।फिर, उपयोग करने के लिए तैयार होने तक एक ग्लास फ्लास्क में नैनोलिपोम को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, बर्फ पर सिंथेटिक mRNA गल। भंवर जमे हुए mRNA और फिर यह अपकेंद्रित्र शीघ्र ही ट्यूब खोलने से पहले ।फिर, नैनोलिपोम सस्पेंशन की विभिन्न मात्रा के साथ सिंथेटिक एमआरएनए के एक माइक्रोग्राम मिलाएं। सेंटीफ्यूज संक्षेप में और नैनोलिपोपप्लेक्स गठन के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। फिर, नैनोलिपोप्लेक्स में नियमित सेल माध्यम का मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।कोशिकाओं को ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले तैयार करें। इसलिए, प्लेट 150, 000 A549 कोशिकाओं को ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले 12 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में। 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड और नियमित सेल माध्यम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।फिर अगले दिन, पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ एक बार तैयार कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें। A549 कोशिकाओं वाले कुओं में से एक में एक तैयार नैनोलिपोप्लेक्स मिश्रण का एक मिलीलीटर जोड़ें। ट्रांसफैक्शन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए 24 घंटे के लिए नियमित परिस्थितियों में इनक्यूबेट, या ट्रांसफैक्शन के बाद सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए 24-72 घंटे के लिए।सुपरनेट निकालें और शेष नैनोलिपोमों को हटाने के लिए पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोएं। साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, पहले प्रत्येक अच्छी तरह से ट्राइप्सिन ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करने के लिए तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रक्रिया को रोकने और ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए नियमित एफबीएस युक्त माध्यम के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। और सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को ध्यान से हटा दें। पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं।फिर कोशिका निर्धारण समाधान के 300 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें। 488 नैनोमीटर पर कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से ठंडा मेथनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें।प्रत्येक कुएं में पीबीएस में भंग DAPI के 300 नैनोमोलर समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट। इसके बाद, DAPI समाधान को हटा दें और कोशिकाओं को 100% मेथनॉल के साथ फिर से धोएं जो पहले शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।यहां दिखाए गए उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस अध्ययन में, नैनोलिपोमों को सिंथेटिक रूप से संशोधित एमआरएनए के लिए उच्च एनकैप्सुलेशन प्रभावकारिता के साथ उत्पन्न किया जाता है। आरएनए क्वांटिफिकेशन किट का उपयोग करके, नैनोलिपोमों की एनकैप्सुलेशन प्रभावकारिता का विश्लेषण एमएनए की मुक्त मात्रा का विश्लेषण करके ईजीएफपी एन्कोडिंग एमआरएनए के एक माइक्रोग्राम के एनकैप्सुलेशन के बाद किया जा सकता है जो समझाया नहीं गया है।नैनोलिपोसोम्स की विभिन्न मात्रा में ईजीएफपी एमआरएनए के एनकैप्सुलेशन के बाद, गठित नैनोलिपोपेक्स को विट्रो में कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड किया जा सकता है और ईजीएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री 24 घंटे बाद ट्रांसफेक्शन का उपयोग करके किया जा सकता है। जैसा कि यहां देखा गया है, यहां तक कि नैनोलिपोमस समाधान का सिर्फ एक माइक्रोलीटर कोशिकाओं के इन्विट्रो के उच्च ट्रांसफैक्शन को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। जब कोशिकाओं को Cy3 लेबल eGFP mRNA युक्त नैनोलिपोसोम से संक्रमित कर रहे हैं, साइटोप्लाज्म में eGFP mRNA की उपस्थिति, साथ ही पहले से ही उत्पादित eGFP प्रोटीन, कल्पना की जा सकती है ।चूंकि नैनोलिपोपेक्स का उपयोग करने वाली कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन से कोशिकाओं पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है, इसलिए कोशिकाओं की व्यवहार्यता का परीक्षण 24 घंटे और ७२ घंटे बाद ट्रांसफैक्शन के बाद किया गया । कोशिका व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव का पता नहीं लगाया जा सकता है जब कोशिकाओं नैनोलिपोपलेक्स के २.५ या पांच माइक्रोलीटर के साथ इलाज किया गया । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, हर समय इथेनॉल मुक्त वातावरण में काम करना याद रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे नैनोलिपोम स्थिरता को नुकसान पहुंच सकता है।डीसी-कोलेस्ट्रॉल को डोप के साथ तैयार और मिलाते समय, आपको प्लास्टिक पिपेट टिप्स के घुलनशील घटकों के साथ घुलित लिपिड के प्रदूषण से बचने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के बाद, तैयार नैनोलिपोमों को तैयारी के दौरान या बाद में आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, खूंटी अणुओं या विशिष्ट एंटीबॉडी के समावेश से स्थिरता में वृद्धि होगी या सक्रिय ऊतक लक्ष्यीकरण शुरू होगा।उत्पन्न नैनोलिपोम आवश्यक सुरक्षा पहलुओं को पूरा करते हैं और एमआरएनए को लक्षित कोशिकाओं तक ले जाने की सुविधा प्रदान करते हैं। एक विशिष्ट चिकित्सीय एनआरएनए के साथ जटिल नैनोलिपोम उदाहरण के लिए ऊतक इंजीनियरिंग या प्रतिस्थापन चिकित्सा के क्षेत्र में उपन्यास एमआरएनए-आधारित चिकित्सीय के विकास में एक आवश्यक योगदान कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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