Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
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1. カチオン性 Nanoliposomes (図 1) の生成
<ol><li>DC コレステロール (3-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) カルバモイルリン] コレステロール塩酸) とドープ (dioleoyl ホスファチジルエタノールアミン) クロロホルム 25 mg/mL の最終的な集中を達成するために、粉末として提供される脂質を溶解します。 注: 保存-20 ° C で分解された脂質</li>
	<li>両方の脂質の 25 mg/mL 原液で動作します。...

提案するプロトコルでは、総合的に変更された mrna は、高い封止効果 NLps の世代だけでなく、細胞の in vitroの信頼性の高いトランスフェクションをについて説明します。また、NLps mRNA は、ターンでは、細胞内タンパク質に翻訳はのリリースを保証します。さらに、NLps を使用して transfections 通常細胞培地で行うことが、高の結果セルの目をトランスフェクション効率を促進し、最後ト?...

治療への応用のため変更された mRNA の使用は最後の数年間で大きな可能性を示しています。心血管、炎症性、複成火山と疾患だけでなく、ワクチンの開発には、mRNA は有望な治療剤1です。
MRNA とタンパク質補充療法では、ターゲット セル2に DNA トランスフェクションに基づいている古典的な遺伝子療法にいくつかの利点を提供しています。MRNA 関数は、細胞質に直接開始します。プラスミド DNA (pDNA)、二本鎖の構築、円形がプロモーター領域および治療用タンパク質3、細胞質でも行為をエンコードする遺伝子の塩基配列を含む DNA それだけに組み込むことが細胞分裂している細胞トランスフェクション時。これは組織1,4transfected セルの数を減らします。具体的には、心筋細胞などの弱い細胞分裂活性を持つ組織の導入は困難な5です。PDNA と対照をなして、トランスフェクションと mRNA の翻訳は組織1,6の分裂と非分裂細胞で発生します。変異原性、または免疫反応7,8が蛋白質符号化の mRNA、目的タンパク質のde novo合成と細胞のトランスフェクション後、宿主ゲノムへの DNA のウイルスの統合が来るかもしれない9,10を自律的に起動します。さらに、タンパク質合成は、ゲノムと干渉や変異原効果11を危険にさらすことがなく個々 の用量で患者のニーズに正確に調整できます。シチジン、ウリジンの12の代わりに擬似ウリジンと 5'-methylcytidine を使用して総合的に生成された mRNA の免疫活性化の可能性を大幅に下げることができます。擬似ウリジン変更された mRNA は、生物学的安定性と有意に高い翻訳能力13に示されています。
臨床応用における mRNA ベース療法の有望なプロパティから利益を得ることができる、セルに mRNA の輸送に適した車両を作成することが不可欠です。この車必要があります非毒性特性の in vitroとin vivoの負担、ヌクレアーゼ劣化に対する mRNA を保護し、十分な細胞内取り込みは、長期にわたる可用性と14の mRNA の翻訳。
薬物送達など単層カーボンナノ チューブ量子ドットのリポソームは、体内のすべての可能なキャリア タイプの間で後者をされている最も15,16を検討しました。リポソームは、10脂質二分子膜からなる小胞。彼らは、疎水性と親水性部分を持つ両親媒性であり、これらの分子の自己整理、球形の二重層が形成された17。リポソーム、内部治療薬または薬カプセル化でき、したがって、酵素分解18から保護します。N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 塩化物 (DOTMA)19リポソーム [1, 2-ビス (oleoyloxy)-3-(トリメチルアンモニオ-) プロパン] (DOTAP)20、および dioctadecylamidoglycylspermine (犬)21、またはDC コレステロール22、よく特徴があり、DNA または RNA の細胞のトランスフェクションの頻繁に使用されます。
カチオン性リポソームは、正荷電脂質および中性リン脂質23を構成します。カチオン性リポソームによる遺伝子導入細胞24,25に核酸の輸送のための最も一般的な方法であります。カチオン性脂質粒子は、核酸分子26のバックボーンに負荷電の隣酸塩グループと複合体を形成します。これらのいわゆるリポプレックスは細胞膜の表面に添付し、エンドサイトーシス、エンドサイトーシスようなメカニズム27セルを入力します。
1989 年、マローンら。正常にカチオン性脂質を介した mRNA トランスフェクション28をについて説明します。しかし、DOTMA と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ドープ) 混合物を使用すると、グループは、DOTMA が細胞毒性28を明示されることを発見しました。また、Zohraらは、mRNA のトランスフェクション試薬29として DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-トリメチル アンモニウム-プロパン塩化ビニル) を使用できることを示した。ただし、細胞の効率的な遺伝子導入の DOTAP をフィブロネクチン29やドープ30など、その他の試薬との組み合わせで使用してください。これまでのところ、DOTMA は遺伝子配達31用市場で最初のカチオン性脂質です。他脂質治療キャリアとして使用されるまたは、臨床試験のさまざまな段階でテストされている (例えば、EndoTAG-私は、脂質キャリアとして DOTAP を含む)、フェーズ II 臨床試験32で現在調査中です。
この作品は、DC コレステロールと麻薬を含む NLps の世代のプロトコルを説明します。このメソッドを実行するは簡単です、サイズの異なる NLps の生成が可能します。ドライ フィルム法による NLp 世代の一般的な目標は、効率的かつ生体適合性細胞の in vitro14,トランスフェクション33をできるように、mRNA に対するリポソームを作成します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

メッセンジャー RNA (mRNA) の開発-正のため様々 な疾患の治療がより重要になる治療法に基づく体外のプロパティ (IVT) mRNA の転写。IVT mRNA の助けを借りて、ターゲット細胞の生理的状態を変更せず目的タンパク質のde novo合成を誘導することができます。さらに、蛋白質の生合成は、IVT mRNA の一時的な効果により正確に制御できます。
細胞の効率的な遺伝子導入の nanoliposomes (NLps) 治療 mRNA の安全かつ効率的な配信手段があります。本研究では、IVT mRNA の配信ベクトルとして安全かつ効率的なカチオン NLps DC コレステロールと 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine で構成される (ドープ) を生成するプロトコルについて説明します。定義を持つ NLps のサイズ、均一な分布と高錯形成能力とドライ フィルム法を使用して作り出すことができます。また、錯を分析するさまざまなテスト システムを提案し、トランスフェクションの効率、合成を使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) mRNA として細胞生存率に及ぼす影響。全体的にみて、提案するプロトコルは進めるし、治療 mRNA の管理を向上させる可能性のある mRNA の錯形成の効果的かつ安全なアプローチを提供します。

前述のプロトコルを使用して、DC コレステロールおよびドープ脂質から成る NLps ドライ フィルム法 (図 1) を使用してを調製しました。準備中、nanoliposome ソリューションは、濁度 (図 2) のさまざまな段階を示しています。
NLps のカプセル化の効果は、無料 RNA 定量キット (<strong c...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA を転写しました。

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

このプロトコルは、治療メッセンジャーRNAのトランスフェクション車両として使用することができる安全で効率的なナノリポソームの生産を可能にする。これらのナノリポソームは、細胞の生存率に影響を与えることなく、タンパク質発現レベルの増加をもたらす細胞におけるmRNA取り込みを促進する。この技術の主な利点は、定義されたサイズと均質な分布を持つ安定したナノリポソームの迅速かつ容易な生成です。さらに、カプセル化されたmRNAを分解から保護し、翻訳を長時間に導きます。この手順のデモンストレーションは、当研究室の博士課程の学生、アントニア・リンクです。この手順を開始するには, 脂質のためのストック溶液を準備します, DCコレステロールとDOPEは、クロロホルムでそれぞれを溶解することにより、25 ミリリットルあたりのミリグラムの最終濃度.溶解したDCコレステロールの40マイクロリットルを、溶かしたDOPEの80マイクロリットルをガラスフラスコに混ぜます。アルゴンガス流下でクロロホルムを15分間気化させます。次に、デシケーターにシリカゲルを充填します。開いたガラスフラスコを内部に入れ、残りのクロロホルムが蒸発するように一晩真空を適用します。得られた脂質膜はガラスフラスコの内部に形成される。翌日、1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、脂質膜を水分補給する。そして、15分間サスペンションをボルテックスします。1時間の超音波浴にサスペンションを置きます。この後、メーカーの指示に従ってミニ押出機を組み立てます。シリンジに液体懸濁液を充填し、押出機の片側に置きます。反対側に空の注射器を置きます。脂質懸濁液を膜内の一方のシリンジから他方へ、約20~25回押し出して懸濁液を押し出す。その後、ナノリポソームをガラスフラスコに4°Cで保存し、使用する準備ができるまで保管します。まず、合成mRNAを氷の上で解凍する。凍結したmRNAをボルテックスし、チューブを開く直前に遠心分離する。次いで、合成mRNAの1マイクログラムを様々な量のナノリポソーム懸濁液と混合する。ナノリポプレックス形成のために、遠心分離機を室温で20分間インキュベートする。その後、通常の細胞培地のミリリットルをナノリポプレックスに加え、上下にピペットして混ぜます。トランスフェクションの1日前に細胞を準備します。したがって、プレート150,000A549細胞は、トランスフェクションの1日前に12ウェルプレートの各ウェルに入る。5%の二酸化炭素と通常の細胞培地で37°Cで細胞を24時間インキュベートします。そして翌日、調製した細胞の各ウェルを1ミリリットルのPBSで1回洗います。調製したナノリポプレックス混合物の1ミリリットルをA549細胞を含むウェルの1つに加えます。トランスフェクション効率を分析するために、通常の条件で24時間インキュベートし、または24〜72時間、トランスフェクション後の細胞生存率を分析します。上清を取り除き、PBSを1ミリリットルずつよく洗い、残りのナノリポソームを取り除きます。細胞をサイトメトリー用に調製するには、まず500マイクロリットルのトリプシンEDTAを各ウェルに加え、37°Cで3分間インキュベートして細胞をトリプシン化します。次に、500マイクロリットルの通常のFBS含有培地を加えてプロセスを停止し、トリプシンを不活性化する。5分間Gの400倍で細胞を遠心分離する。そして、細胞ペレットを邪魔することなく、上清を慎重に除去します。PBSの1ミリリットルで細胞を洗います。その後、細胞固定液の300マイクロリットルで細胞を再中断し、フローサイトメトリーチューブに転送します。フローサイトメーターを使用して、488ナノメートルで細胞を分析します。蛍光顕微鏡用の細胞を準備するには、各ウェルに冷やしたメタノールを1ミリリットル加えて細胞を固定します。PBSに溶解したDAPIの300ナノモル溶液を500マイクロリットルずつ加えて各ウェルに溶解します。暗闇の中で5分間インキュベートします。この後、DAPI溶液を取り出し、以前にマイナス20度で保存した100%メタノールで細胞を再び洗浄します。蛍光顕微鏡を使用して、ここに示す励起波長と発光波長を使用して細胞を解析します。本研究では、合成修飾mRNAに対する高いカプセル化効果を有するナノリポソームが生成される。RNA定量キットを用いて、ナノリポソームのカプセル化有効性を、カプセル化されていないmRNAの自由量を分析することによって、eGFPコードmRNAの1マイクログラムのカプセル化後に分析することができる。異なる量のナノリポソームでEGFP mRNAをカプセル化した後、形成されたナノリポプレックスをインビトロの細胞と共にインキュベートすることができ、eGFP発現細胞の割合は、トランスフェクション後24時間のフローサイトメトリーを使用して分析することができる。ここで見られるように、ナノリポソーム溶液の1マイクロリットルであっても、細胞インビトロの高いトランスフェクションを達成するのに十分である。細胞がcy3を含むナノリポソームをトランスフェクトする場合には、eGFP mRNAを標識したeGFP mRNAを細胞質に、ならびに既に産生したeGFPタンパク質に存在させることが、可視化できる。ナノリポプレックスを用いた細胞のトランスフェクションは細胞に悪影響を及ぼす可能性があるため、トランスフェクション後24時間72時間後に細胞の生存率を試験した。細胞が2.5または5マイクロリットルのナノリポプレックスで処理された場合、細胞生存率に対する影響は検出できなかった。この手順を試みるとき、これはナノリポソームの安定性を損なう可能性があるため、常にエタノールフリーの環境で作業することを覚えておくことが重要です。DCコレステロールとDOPEを調製し混合する際には、溶解した脂質とプラスチックピペットチップの可溶性成分の汚染を避けるために、ガラスピペットを使用する必要があります。このプロトコルに従って、生成されたナノリポソームは、調製中または調製後に容易に操作することができる。例えば、PEG分子または特異的抗体の組み込みは、安定性の向上または活性組織標的化を開始するであろう。生成されたナノリポソームは、必要な安全性の側面を満たし、標的細胞へのmRNA取り込みを容易にする。特定の治療nRNAと複合体化したナノリポソームは、例えば組織工学または置換療法の分野における新規mRNAベースの治療薬の開発に不可欠な貢献をすることができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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