Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
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1. 양이온 Nanoliposomes (그림 1)의 생성
<ol><li>DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] 콜레스테롤 염)과 마약 (dioleoyl phosphatidylethanolamine), 25 mg/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 클로 프롬에 분말으로 전달 지질을 분해. 참고:-20 ° c.에 녹은 지질 저장</li>
	<li>25 mg/mL 두 지질 재고 솔루션 사용. 녹은 DC-콜레스테롤과 유리 플라스 크에 녹아 마약의 80 µ L의 믹스 40 µ L.<br...

제시 프로토콜 종합적 수정된 mRNA에 대 한 높은 캡슐화 효능 NLps의 세대 뿐만 아니라 세포에 생체 외에서의 신뢰할 수 있는 transfection에 설명합니다. 또한,는 NLps 차례로 셀 내부 기능적인 단백질으로 번역은 mRNA의 출시를 보장 합니다. 또한, NLps를 사용 하 여 transfections 일반 세포 매체에서 수행할 수 있습니다, 그리고 높은 결과 viabilities 동안 transfection, 세포 transfection 후 최대 3 일.
<p class="...

치료 응용 프로그램에 대 한 수정 된 mRNA의 사용은 지난 몇 년 동안에에서 큰 잠재력을 보이고 있다. 심장 혈관, 염증, 그리고 monogenetic 질병에서 뿐만 아니라 백신 개발에, mRNA는 유망한 치료 에이전트1.
MRNA와 단백질 대체 요법 대상 셀2에 DNA transfection에 따라 고아 한 유전자 치료를 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. MRNA 함수는 cytosol에서 직접 시작합니다. 비록 플라스 미드 DNA (pDNA), 더블-좌초의 구조, 원형 발기인 지역과 치료 단백질3을 또한 행위 cytosol, 인코딩 유전자 시퀀스를 포함 하는 DNA 그것만 통합 될 수 있다 유사 분열을 겪고 있는 셀에 transfection의 때. 이 조직1,4transfected 세포의 수를 줄입니다. 특히, 심장 세포, 등 약한 유사 분열 활동 조직의 transfection 어려운5입니다. PDNA, 달리 transfection 그리고 mRNA의 번역 조직1,6에 mitotic 그리고 비 mitotic 세포에서 발생합니다. 변이 원 성 영향 또는 면역 반응7,8, 하지만 원하는 단백질의 de novo 종합 단백질 인코딩 mRNA와 세포의 transfection 후 호스트 게놈 DNA의 바이러스 성 통합 올 수 있습니다. 9,10자율적으로 시작합니다. 또한, 단백질 합성 게놈을 방해 하 고 변이 원 성 영향11위험 없이 개별 복용량을 통해 환자의 필요를 정확 하 게 조정할 수 있습니다. 합성으로 생성 된 mRNA의 면역 활성화 잠재력 의사 uridine 및 5'-methylcytidine uridine 및 cytidine12대신 사용 하 여 극적으로 낮아질 수 있습니다. 의사 uridine 수정된 mRNA 또한 증가 생물학적 안정성과 상당히 높은 변환 용량13을 보였다.
mRNA 기반 치료 임상 응용에 유망한 속성에서 이익을 얻을 수 있을, 하 셀으로 mRNA의 전송에 대 한 적합 한 차량을 만들 필수적 이다. 이 차량은 한다 곰 비 독성 속성에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, 보호 nuclease 저하에 대 한 mRNA 하 고 장기간된 가용성 및14mRNA 번역에 대 한 충분 한 세포질 통풍 관을 제공.
Vivo에서 약물 전달, 탄소 나노튜브, 양자 점, 등 리에 대 한 모든 가능한 캐리어 종류 중에서 후자 되었습니다 공부 가장15,16. 리는 지질 bilayer10구성 된 소포. 그들은 amphiphilic는 소수 성 및 친수성 섹션, 그리고 이러한 분자의 자기 배열을 통해 구형 더블 레이어는 형성된17. 리, 내부 치료 대리인 또는 마약 수 캡슐화 되며, 따라서, 효소 저하18에서 보호. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 염화 (DOTMA)19를 포함 하는 리 [1, 2-비스 (oleoyloxy)-3-프로 판 (trimethylammonio)] (DOTAP)20및 dioctadecylamidoglycylspermine (개)21또는 DC-콜레스테롤22, 잘 특징 및 DNA 또는 RNA 세포 transfection에 자주 사용.
양이온 리 충전 된 지질과 충전된 인지질23구성. 양이온 리 통해 transfection 셀24,25으로 핵 산의 수송을 위한 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 양이온 지질 입자 핵 산 분자26의 등뼈에 마이너스로 충전 된 인산 염 그룹으로 복합물을 형성 한다. 이러한 소위 lipoplexes 세포 막의 표면에 부착 하 고 endocytosis 또는 endocytosis 같은 메커니즘27셀을 입력 합니다.
1989 년에 말론 외. 성공적으로 양이온 지질 중재 mRNA transfection28설명. 그러나, 그룹 DOTMA 각 세포 독성 효과28성 발견 혼합물의 DOTMA 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (마약)를 사용 하 여. 또한, Zohra 외 보여주었다 DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-프로 판 염화) mRNA transfection 시 약29으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포의 효율적인 transfection에 대 한 DOTAP는 다른 시 약, fibronectin29 등 마약30와 함께에서 사용 해야 합니다. 지금까지, DOTMA 유전자 배달31사용 시장에 첫 번째 양이온 지질 이었다. 다른 지질 치료 운반대로 사용 또는 임상 시험의 다른 단계에서 테스트 되 고 있습니다 (예를 들어, EndoTAG-나 지질 운반대로 DOTAP를 포함)는 현재 단계 II 임상 시험32에서 조사 되 고.
이 작품에서는 NLps DC 콜레스테롤 및 마약의 세대에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 실행 하기 쉬운 이며 다양 한 크기의 NLps 생성 수 있습니다. 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 NLp의 일반적인 목표는 mRNA complexation, 따라서 효율적이 고 생체 세포 transfection 생체 외에서14,33를 허용에 대 한 리를 만드는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

메신저 RNA (mRNA)의 개발-기반 치료제 다양 한 질병의 치료에 긍정적인 때문에 점점 더 중요 한 된다 생체 외에서 의 속성 (IVT) mRNA를 베 꼈 다. IVT mRNA의 도움으로, 원하는 단백질의 de novo 종합 목표 셀의 생리 적 상태를 변경 하지 않고 유도 될 수 있다. 또한, 단백질 생 합성 IVT mRNA의 일시적 효과의 한 정확 하 게 제어할 수 있습니다.
셀의 효율적인 transfection nanoliposomes (NLps) 치료 mRNA에 대 한 안전 하 고 효율적인 배달 차량을 나타낼 수 있습니다. 이 연구는 IVT mRNA에 대 한 배달 벡터로 안전 하 고 효율적인 양이온 NLps DC 콜레스테롤 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 구성 (마약)을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. NLps를 정의 하는 데 크기, 균일 분포, 그리고 높은 complexation 용량, 그리고 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 생성 될 수 있다. 또한, 우리가 다른 테스트 시스템의 complexation 분석을 제시 하 고 합성을 사용 하 여 transfection 신진대사 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) mRNA, 뿐만 아니라 세포 생존 능력에 미치는 영향. 전반적으로, 제시 프로토콜 mRNA complexation 하 고 치료 mRNA의 관리를 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 효과적이 고 안전한 접근을 제공 합니다.

설명 된 대로 프로토콜을 사용 하 여, DC-콜레스테롤과 마약 지질 구성 된 NLps 드라이 필름 방법 (그림 1)를 사용 하 여 준비 되었다. 준비를 하는 동안 nanoliposome 솔루션 탁 (그림 2)에서 다른 단계를 보여 줍니다.
NLps의 캡슐화 효능 다음 mRNA, 캡슐화 되지는 RNA 정량화 키트 (<strong class="x...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

이 프로토콜은 치료 메신저 RNA에 대한 경피 차량으로 사용될 수있는 안전하고 효율적인 나노 리포솜의 생산을 허용합니다. 이러한 nanoliposomes 세포 생존에 영향을 주지 않고 증가 된 단백질 발현 수준을 초래 하는 세포에서 mRNA 섭취를 촉진. 이 기술의 주요 장점은 정의된 크기와 균일한 분포를 가진 안정적인 나노 리포솜의 빠르고 쉬운 생성입니다.더욱이, 그들은 분해에서 캡슐화된 mRNA를 보호하고 장기간 번역으로 이끌어 내도록 유도합니다. 절차를 시연하는 것은 해부학 링크, 우리의 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 지질, DC 콜레스테롤 및 DOPE에 대한 재고 솔루션을 클로로폼으로 용해하여 밀리리터 당 25 밀리그램의 최종 농도로 용해하십시오.용존 DC 콜레스테롤의 40 마이크로리터를 유리 플라스크에 용존 DOPE의 80 마이크로리터와 혼합합니다. 아르곤 가스 흐름하에서 15분 동안 클로로폼을 증발시다. 다음으로, 실리카 젤로 건조기충전을 채웁니다.열린 유리 플라스크를 내부에 놓고 진공을 하룻밤 동안 적용하여 남은 클로로폼이 증발되도록 합니다. 결과 지질 필름은 유리 플라스크 내부에 형성됩니다. 다음 날, 지질 필름을 수화하기 위해 뉴클레아제 프리 워터 1 밀리리터를 추가합니다.그리고 15 분 동안 서스펜션을 소용돌이. 서스펜션을 초음파 욕조에 1 시간 동안 놓습니다. 이 후 제조업체의 지침에 따라 미니 압출기를 조립합니다.액체 현탁액으로 주사기를 채우고 압출기의 한쪽을 놓습니다. 다른 쪽에 빈 주사기를 놓습니다. 한 주사기에서 다른 주사기로 멤브레인을 통해 지질 현탁액을 약 20-25회 눌러 현탁액을 제거합니다.그런 다음 나노 리포솜을 사용 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 유리 플라스크에 보관하십시오. 첫째, 얼음에 합성 mRNA를 해동. 얼어 붙은 mRNA를 소용돌이시키고 튜브를 열기 직전에 원심분리기.그런 다음 합성 mRNA의 마이크로그램 1개를 다양한 양의 나노리포솜 현탁액과 혼합합니다. 원심분리기는 나노리포플렉스 형성을 위해 실온에서 20분 동안 잠깐 배양합니다. 그런 다음, 나노 리포플렉스에 일반 세포 매체의 밀리리터를 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.감염되기 하루 전에 세포를 준비합니다. 따라서, 플레이트 150, 000 A549 세포는 12웰 플레이트의 각 웰내로 전환되기 하루 전에. 24시간 동안 5%의 이산화탄소와 일반 세포 배지로 37도에서 세포를 배양합니다.그런 다음 다음 날, 준비된 세포의 각 우물을 PBS 의 1 밀리리터로 한 번 씻으시다. A549 세포를 함유하는 우물 중 하나에 준비된 나노리포플렉스 혼합물1밀리리터를 넣습니다. 24시간 동안 일반 조건에서 배양하여 형질 전환 효율을 분석하거나 24-72시간 동안 배양후 세포 생존가능성을 분석한다.상체를 제거하고 나머지 나노 리포솜을 제거하기 위해 PBS의 1 밀리리터로 각각 잘 씻으라. 세포측정을 위해 세포를 준비하려면 먼저 500마이크로리터의 트립신 EDTA를 각 우물에 추가하고 37도에서 세포를 트립시네이션하는 배양합니다. 다음으로, 일반 FBS 함유 매체500마이크로리터를 추가하여 공정을 중지하고 트립신을 비활성화합니다.세포를 400배 G로 5분간 원심분리합니다. 그리고 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으시다.그런 다음 세포 고정 용액의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 유동 세포 측정 튜브로 옮김 튜브로 옮김합니다. 488 나노미터에서 세포를 분석하기 위해 유동 세포계를 사용합니다. 형광 현미경 검사법을 위해 세포를 준비하려면, 세포를 고치기 위하여 각 우물에 차가운 메탄올의 1 밀리리터를 추가합니다.PBS에 용해된 300나노몰러 용액의 500마이크로리터를 각각 양정에 추가합니다. 어둠 속에서 5분간 배양하세요. 그 후 DAPI 용액을 제거하고 이전에 섭씨 영하 20도에 저장되었던 100% 메탄올로 세포를 다시 세척합니다.여기에 표시된 여기를 이용한 발광 및 방출 파장을 사용하여 세포를 분석하기 위해 형광 현미경을 사용한다. 이 연구에서, 나노 리포솜은 합성 변형 된 mRNA에 대한 높은 캡슐화 효능으로 생성됩니다. RNA 정량화 키트를 사용하여, 나노리포좀의 캡슐화 효능은 캡슐화되지 않은 mRNA의 자유로운 양을 분석하여 mRNA를 인코딩하는 1마이크로그램의 캡슐화 후에 분석될 수 있다.상이한 양의 나노리포좀에서 EGFP mRNA를 캡슐화한 후, 형성된 나노리포플렉스는 체외세포와 함께 배양될 수 있으며 eGFP 발현 세포의 백분율은 24시간 유동 세포측정을 사용하여 분석될 수 있다. 여기에서 볼 수 있듯이, 나노 리포좀용의 마이크로리터 1개조차도 세포 내외의 높은 배분을 달성하기에 충분합니다. 세포가 Cy3 표지 eGFP mRNA를 포함하는 나노리포좀으로 전감염될 때, 세포질에서 eGFP mRNA의 존재뿐만 아니라 이미 생산된 eGFP 단백질이 시각화될 수 있다.nanolipoplexes를 사용하여 세포의 이식은 세포에 불리한 효력이 있을 수 있기 때문에, 세포의 생존은 24 시간 및 72 시간 후에 시험되었습니다 후에 변환 후에 시험되었습니다. 세포가 나노리포플렉스의 2.5 또는 5마이크로리터로 치료될 때 세포 생존가능성에 미치는 영향은 검출될 수 없었다. 이 절차를 시도할 때, 이 나노 liposome 안정성을 해칠 수 있기 때문에 항상 에탄올없는 환경에서 일하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.DC 콜레스테롤을 DOPE와 준비하고 혼합하는 동안, 당신은 플라스틱 파이펫 팁의 용해 성분용 지질의 오염을 방지하기 위해 유리 파이펫을 사용해야합니다. 이 프로토콜에 따라, 생성된 나노리포솜은 준비 중 또는 이후에 쉽게 조작될 수 있다. 예를 들면, PEG 분자 또는 특정 항체의 통합은 증가한 안정성으로 이끌어 내거나 활성 조직 표적을 시작할 것입니다.생성된 나노리포솜은 필요한 안전 측면을 충족시키고 표적 세포에 대한 mRNA 섭취를 용이하게 한다. 특정 치료 nRNA로 복합적인 Nanoliposomes는 예를 들어 조직 공학 또는 대체 요법 분야에서 새로운 mRNA 기반 치료법의 개발에 필수적인 기여를 할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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연구

생체공학

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