Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA at JoVE.com

1. geração de Nanoliposomes catiônica (Figura 1)
<ol><li>Dissolva os lipídios DC-colesterol (3beta-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil] colesterol cloridrato) e drogas (fosfatidiletanolamina dioleoyl), fornecido como um pó, em clorofórmio para obter uma concentração final de 25 mg/mL. Nota: Guarde os lipídios dissolvidos em-20 ° C.</li>
	<li>Trabalhar com 25 mg/mL de solução de ambos os lipídios. Mix de 40 µ l do DC-colesterol dissolvido e 80 µ l da droga dissolv...

O protocolo apresentado descreve a geração de NLps com eficácia elevada de encapsulamento para mRNA sinteticamente modificado, assim como o transfection confiável de células em vitro. Além disso, os NLps garantir a liberação do mRNA, que por sua vez, é traduzida em uma proteína funcional no interior das células. Além disso, os transfections usando NLps podem ser executadas no meio celular regular, resultando em alta realidades da pilha durante a transfeccao, e durar até três dias depois do transfec...

O uso de mRNA modificados para aplicações terapêuticas tem mostrado grande potencial no último par de anos. Em doenças cardiovasculares, inflamatórias e eurogenética, bem como no desenvolvimento de vacinas, o mRNA é um promissor agente terapêutico1.
Terapia de reposição de proteína com mRNA oferece diversas vantagens sobre a terapia de gene clássica, que se baseia a transfeccao de ADN em células alvo2. A função do mRNA inicia diretamente no citosol. Embora o plasmídeo de DNA (pDNA), uma construção de dupla-hélice, circular DNA contendo uma região promotora e uma sequência de genes codificação da proteína terapêutica3, também atos no citosol, pode apenas ser incorporado em células que estão passando por mitose no momento do transfection. Isso reduz o número de células transfectadas em tecido1,4. Especificamente, o transfeccao de tecidos com atividade fraca mitose, como as células cardíacas, é difícil5. Em contraste com pDNA, a transfeccao e tradução do mRNA ocorrem em células mitóticas e não-mitótica no tecido1,6. A integração viral do DNA no genoma do hospedeiro pode vir com efeitos mutagénicos ou reações imunes7,8, mas depois a transfecção de células com um mRNA de codificação de proteínas, a síntese de novo da proteína desejada começa-se autonomamente9,10. Além disso, a síntese de proteína pode ser ajustada precisamente a necessidade do paciente através de doses individuais, sem interferir com o genoma e arriscar efeitos mutagénicos11. O potencial imunológico-ativando de mRNA sinteticamente gerado poderia ser drasticamente reduzido usando pseudo uridina e 5'-methylcytidine em vez de uridina e citidina12. Uridina pseudo mRNA modificados também foi mostrado para ter uma maior estabilidade biológica e um significativamente maior capacidade translacional13.
Para poder beneficiar das propriedades promissoras de terapia baseada em mRNA em aplicações clínicas, é essencial para criar um veículo adequado para o transporte do mRNA para a célula. Este veículo deve suportar tóxicos propriedades in vitro e em vivo, proteger o mRNA contra nuclease-degradação e prever uma disponibilidade prolongada e tradução do mRNA14suficiente absorção celular.
Entre todos os tipos de portador possível para na vivo entrega da droga, como nanotubos de carbono, pontos quânticos e lipossomas, este último tem sido estudado a mais de15,16. Lipossomas são vesículas consistindo de bicamada lipídica10. Eles são anfifílica com uma hidrofóbica e uma parte hidrofílica, e através do auto arranjo destas moléculas, uma dupla camada esférica é formada de17. Dentro os lipossomas, agentes terapêuticos ou drogas podem ser encapsuladas e, assim, protegidas contra a degradação enzimática de18. Lipossomas contendo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloreto (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimetilamonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cães)21, ou DC-colesterol22, estão bem caracterizados e frequentemente utilizada para transfecção celular com DNA ou RNA.
Os lipossomas catiônicos compõem um lipido carregado positivamente e um fosfolipídeo descarregado23. Transfecção via catiônicos lipossomas é um dos métodos mais comuns para o transporte de ácidos nucleicos em células24,25. As partículas de lipídios catiônicos formam complexos com os grupos fosfato negativamente carregados na espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico26. Estes chamados lipoplexes anexar à superfície da membrana celular e entrar na célula por endocitose ou mecanismos de endocitose-como27.
Em 1989, Malone et al. com êxito descrito mediada por lipídios catiônicos mRNA transfeccao28. No entanto, usando uma mistura de DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), o grupo encontrou que DOTMA manifestou efeitos citotóxicos28. Além disso, Zohra et al mostrou que DOTAP (cloreto de 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilamónio-propano) pode ser usado como um de reagente de Transfeccao de mRNA29. No entanto, para a eficiente transfecção de células, DOTAP deve ser usado em combinação com outros reagentes, tais como fibronectina29 ou DOPE30. Até agora, DOTMA foi o primeiro lipídios catiônicos no mercado usado para o gene entrega31. Outros lipídios são utilizados como terapêuticas portadores ou estão a ser testados em diferentes fases de ensaios clínicos, (por exemplo, EndoTAG-eu, contendo DOTAP como um portador de lipídios), atualmente está sendo investigado em uma fase-II de julgamento clínico32.
Este trabalho descreve um protocolo para a geração de NLps contendo DC-colesterol e drogas. Esse método é fácil de executar e permite a geração de NLps de tamanhos diferentes. O objetivo geral de PNL geração usando o método seco-filme é criar lipossomas para complexação de mRNA, permitindo assim a célula eficiente e biocompatível transfecção em vitro14,33.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

O desenvolvimento do RNA mensageiro (mRNA)-com base em terapêutica para o tratamento de várias doenças se torna cada vez mais importante devido o positivo Propriedades in vitro transcrito (IVT) mRNA. Com a ajuda de IVT mRNA, a síntese de novo de uma proteína desejada pode ser induzida sem alterar o estado fisiológico da célula alvo. Além disso, a biossíntese de proteínas pode ser controlada precisamente devido ao efeito transiente de mRNA IVT.
Para a eficiente transfecção de células, nanoliposomes (NLps) pode representar um veículo de entrega segura e eficiente para a terapêutica do mRNA. Este estudo descreve um protocolo para gerar segura e eficiente catiônica NLps consistindo de DC-colesterol e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como um vetor de entrega para IVT mRNA. NLps tendo um definido tamanho, uma distribuição homogénea e uma capacidade de complexação de alta e pode ser produzidos usando o método seco-filme. Além disso, apresentamos os sistemas de teste diferente para analisar sua complexação e eficácias de transfeccao usando sintética reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, bem como seus efeitos sobre a viabilidade celular. No geral, o protocolo apresentado fornece uma abordagem eficaz e segura para complexação de mRNA, que pode avançar e melhorar a administração de terapêutica mRNA.

Usando o protocolo como descrito, NLps consistindo de lipídeos DC-colesterol e droga foram preparadas usando o método seco-filme (Figura 1). Durante a preparação, a solução de nanoliposome mostra diferentes fases na turbidez (Figura 2).
A eficácia de encapsulamento do NLps pode ser analisada após o encapsulamento de 1 µ g de mRNA eGFP-codificação, analisando ...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Este protocolo permite a produção de nanoliposomos seguros e eficientes que podem ser usados como veículos de transfecção para RNA mensageiro terapêutico. Esses nanoliposomos facilitam a absorção de mRNA nas células, resultando em aumento dos níveis de expressão proteica sem afetar a viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica é a geração rápida e fácil de nanoliposomos estáveis com tamanho definido e distribuição homogênea.Além disso, protegem o mRNA encapsulado da degradação e levam a uma tradução prolongada. Demonstrando o procedimento estará Antonia Link, uma estudante de doutorado do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare soluções de estoque para os lipídios, DC-colesterol e DOPE, dissolvendo cada um em clorofórmio para uma concentração final de 25 miligramas por mililitro.Misture 40 microliters do DC-colesterol dissolvido com 80 microliters da DROGA dissolvida em um frasco de vidro. Vaporize o clorofórmio sob um fluxo de gás argônio por 15 minutos. Em seguida, encha um desiccator com gel de sílica.Coloque o frasco de vidro aberto dentro e aplique um vácuo durante a noite para garantir que o clorofórmio restante seja evaporado. O filme lipíduo resultante se formará dentro do frasco de vidro. No dia seguinte, adicione um mililitro de água livre nuclease para reidratar o filme lipíduo.E vórtice da suspensão por 15 minutos. Coloque a suspensão em um banho de sônica por uma hora. Depois disso, monte a mini extrusora de acordo com as instruções do fabricante.Encha uma seringa com a suspensão líquida e coloque-a de um lado da extrusora. Coloque uma seringa vazia do outro lado. Pressione a suspensão lipídica através da membrana de uma seringa para a outra, aproximadamente 20-25 vezes para extrusir a suspensão.Em seguida, armazene os nanoliposomos em um frasco de vidro a quatro graus Celsius até estar pronto para usar. Primeiro, descongele o mRNA sintético no gelo. Vórtice o mRNA congelado e, em seguida, centrifuá-lo pouco antes de abrir o tubo.Em seguida, misture um micrograma do mRNA sintético com várias quantidades de suspensão nanoliposome. Centrifugar brevemente e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para formação de nanolipoplex. Em seguida, adicione mililitro de meio celular regular ao nanolipoplex e misture por pipetação para cima e para baixo.Prepare as células um dia antes da transfecção. Portanto, placa 150.000 células A549 em cada poço de uma placa de 12 poços um dia antes da transfecção. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e meio celular regular durante 24 horas.Então no dia seguinte, lave cada poço de células preparadas uma vez com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de uma mistura de nanolipoplex preparado a um dos poços que contêm as células A549. Incubar em condições regulares por 24 horas para analisar a eficiência da transfecção, ou por 24-72 horas para analisar a viabilidade celular após a transfecção.Remova o supernatante e lave cada poço com um mililitro de PBS para remover os nanoliposomos restantes. Para preparar as células para a citometria, primeiro adicione 500 microliters de trippsina EDTA a cada poço e incubar a 37 graus Celsius por três minutos para tentarpsinizar as células. Em seguida, adicione 500 microliters de meio regular contendo FBS para interromper o processo e inativar a trippsina.Centrifugar as células a 400 vezes G por cinco minutos. E remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota celular. Lave as células com um mililitro de PBS.Em seguida, suspenda novamente as células em 300 microliters da solução de fixação celular e transfira-as para tubos de citometria de fluxo. Use um citómetro de fluxo para analisar as células a 488 nanômetros. Para preparar as células para microscopia de fluorescência, adicione um mililitro de metanol resfriado a cada poço para corrigir as células.Adicione 500 microliters de uma solução de 300 nanomolar de DAPI dissolvida em PBS a cada poço. Incubar no escuro por cinco minutos. Depois disso, remova a solução DAPI e lave as células novamente com 100% de metanol que foi armazenado anteriormente a menos 20 graus Celsius.Use um microscópio de fluorescência para analisar as células usando os comprimentos de onda de excitação e emissão mostrados aqui. Neste estudo, nanoliposomos são gerados com alta eficácia de encapsulamento para mRNA sintéticamente modificado. Utilizando o kit de quantificação de RNA, a eficácia de encapsulamento dos nanoliposomos pode ser analisada após o encapsulamento de um micrograma de mRNA de codificação eGFP, analisando a quantidade livre de mRNA que não é encapsulada.Após o encapsulamento do EGFP mRNA em diferentes quantidades de nanoliposomos, os nanolipoplexos formados podem ser incubados com células in vitro e a porcentagem de células expressas por eGFP pode ser analisada usando citometria de fluxo 24 horas após a transfecção. Como visto aqui, mesmo apenas um microliter da solução de nanoliposomos é suficiente para alcançar uma alta transfecção das células invitro. Quando as células são transfeinadas com nanoliposomos contendo cy3 rotulados eGFP mRNA, a presença do eGFP mRNA no citoplasma, bem como a proteína eGFP já produzida, pode ser visualizada.Uma vez que a transfecção de células usando nanolipoplexos pode ter efeitos adversos nas células, a viabilidade das células foi testada após 24 horas e 72 horas após a transfecção. Nenhum efeito na viabilidade celular pôde ser detectado quando as células foram tratadas com 2,5 ou cinco microlitros de nanolipoplexos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de etanol o tempo todo, pois isso pode prejudicar a estabilidade nanoliposome.Enquanto prepara e mistura o DC-colesterol com DOPE, você deve usar uma pipeta de vidro para evitar a contaminação dos lipídios dissolvidos com componentes solúveis de pontas de pipeta plástica. Seguindo este protocolo, os nanoliposomos gerados podem ser facilmente manipulados durante ou após a preparação. Por exemplo, a incorporação de moléculas de PEG ou anticorpos específicos levaria a um aumento da estabilidade ou iniciaria a segmentação ativa do tecido.Os nanoliposomos gerados preenchem os aspectos de segurança necessários e facilitam a absorção de mRNA para as células-alvo. Nanoliposomos complexos com um nRNA terapêutico específico podem contribuir essencialmente para o desenvolvimento de novas terapêuticas baseadas em mRNA no campo da engenharia de tecidos ou terapia de substituição, por exemplo.

Research

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