Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA at JoVE.com

1. поколение катионного Nanoliposomes (рис. 1)
<ol><li>Растворите липиды DC-холестерина (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] холестерина гидрохлорид) и ДОПИНГ (dioleoyl фосфатидилэтаноламина), поставляется в виде порошка, в хлороформе для достижения конечной концентрации 25 мг/мл. Примечание: Х...

Представленные протокол описывает поколения NLps с высоким инкапсуляции эффективность для искусственно модифицированных мРНК, а также надежных transfection клетки в пробирке. Кроме того NLps гарантируют освобождение мРНК, который в свою очередь, будет переведен на функциональных белков в...

Использование модифицированных мРНК для терапевтического применения показывает большой потенциал в последние пару лет. В моногенетическими, сердечно-сосудистой и воспалительных заболеваний, а также в разработке вакцин мРНК является перспективным терапевтический агент1.
Белка заместительной терапии с мРНК предлагает несколько преимуществ по сравнению с классической генная терапия, которая основана на ДНК трансфекции в целевой ячейки2. МРНК функция инициирует непосредственно в цитозоль. Хотя плазмидной ДНК (pDNA), конструкция двунитевая, циркуляр ДНК, содержащие промоутер региона и последовательности гена кодирования терапевтических белков-3, также акты в цитозоле, оно может только быть включены в клетки, которые проходят митоз в то время transfection. Это уменьшает количество transfected клеток в тканях1,4. В частности transfection тканей с слабой митоз активности, таких как сердечные клетки, является трудно5. В отличие от pDNA transfection и перевод мРНК происходят в митотическая и не митотическая клеток в ткани1,6. Вирусная интеграции ДНК в хост геномов может прийти с мутагенных эффектов или иммунных реакций7,8, но после transfection клетки с мРНК белка кодирования, de novo синтез белка желаемого начинает самостоятельно9,10. Кроме того синтез белков может быть скорректирована именно к потребности пациента путем индивидуальных доз, без вмешательства с геном и рискуя мутагенных эффектов11. Иммунной активации потенциал искусственно созданного мРНК может быть значительно снижен с помощью псевдо-уридина и 5'-methylcytidine вместо уридина и Цитидин12. Псевдо-уридина модифицированных мРНК также было показано повышение биологической стабильности и значительно выше трансляционная потенциала13.
Чтобы иметь возможность воспользоваться перспективных свойств на основе мРНК терапии в клинических приложений, важно создать подходящее транспортное средство для перевозки мРНК в клетку. Этот автомобиль должен нести нетоксичные свойства в пробирке и в естественных условиях, защитить против нуклеиназы деградации мРНК и обеспечивают достаточно клеточного поглощения для длительного доступности и перевод мРНК14.
Среди всех типов возможных перевозчика в естественных условиях доставки наркотиков, например, углеродных нанотрубок, квантовые точки и липосомы, последние были изучены наиболее15,16. Липосомы являются везикулы, состоящий из липидного бислоя10. Они амфифильных с гидрофобных и гидрофильных секции, и через самостоятельной расположение этих молекул, сферические двойной слой является форматом17. Внутри липосомы терапевтических агентов или наркотиков можно инкапсулировать и, таким образом, защищен от18энзимной деградации. Липосомы, содержащие N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium хлорид (DOTMA)19, [1,2-бис (oleoyloxy) -3-пропан (trimethylammonio)] (DOTAP)20и21dioctadecylamidoglycylspermine (собаки), или DC-холестерин22, хорошо характеризуется и часто используется для сотовых трансфекции с ДНК или РНК.
Катионный липосомы составляют положительно заряженных липидов и незаряженных фосфолипидного23. Трансфекция через Катионный липосомы является одним из наиболее распространенных методов для перевозки нуклеиновых кислот в клетки24,25. Катионоактивный липид частицы образуют комплексы с отрицательно заряженных фосфатными группами в основу нуклеиновых кислот молекул26. Эти так называемые lipoplexes придают поверхности клеточной мембраны и войти в камеру через эндоцитоз или эндоцитоза как механизмы27.
В 1989 году Мэлоун и др. успешно описал катионоактивный липид опосредованной мРНК трансфекции28. Однако используя смесь DOTMA и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ), Группа обнаружила, что DOTMA проявляется цитотоксических эффектов28. Кроме того Зохра et al. показал, что DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-триметиламмония пропан хлорид) может использоваться как реагент мРНК в трансфекции29. Однако для эффективного transfection клетки, DOTAP должен использоваться в сочетании с другими реагенты, такие как фибронектин29 или30ДОПИНГ. Пока DOTMA был первым Катионный липидов на рынке, используемых для доставки генов31. Другие липиды используются как терапевтические перевозчиков или тестируются на разных стадиях клинических испытаний, (например, EndoTAG-I, содержащее DOTAP как перевозчик липидов), в настоящее время изучается в фазы II клинических судебного32.
Эта работа описывает протокол для поколения NLps, содержащих DC-холестерин и ДОПИНГ. Этот метод легко выполнить и позволяет генерировать NLps разных размеров. Общая цель НЛП поколения, с помощью метода сухой фильм является создание липосом для комплексообразованию мРНК, таким образом позволяя transfection клеток эффективным и биосовместимых в vitro14,33.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

Разработка матричная РНК (мРНК)-на основе терапии для лечения различных заболеваний становится все более важным из-за положительные свойства в vitro трансляции мРНК (IVT). С помощью IVT мРНК de novo синтез желаемого белка может быть вызван без изменения физиологического состояния целевой ячейки. Кроме того Биосинтез белка может точно управляться из-за переходного эффекта ИВТ мРНК.
Для эффективного transfection клетки nanoliposomes (NLps) может представлять средство безопасной и эффективной доставки для терапевтических мРНК. Это исследование описывает протокол для создания безопасной и эффективной катионного NLps состоящий из DC-холестерина и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ) как вектор доставки для ИВТ мРНК. NLps, имеющие определенный размер, однородное распределение и высокая комплексообразованию потенциала и могут быть изготовлены с использованием метода сухой фильм. Кроме того, мы представляем различные тест-систем для анализа их комплексообразования и трансфекции узкоспециализированного с использованием синтетических расширение Зеленый флуоресцентный белок (eGFP) мРНК, а также их влияние на жизнеспособность клеток. В целом представленные протокол обеспечивает эффективный и безопасный подход мРНК комплексообразование, который может заранее и улучшить администрации терапевтических мРНК.

Используя протокол как описано, NLps, состоящий из липидов, DC-холестерин и ДОПИНГ были подготовлены с использованием метода сухой фильм (рис. 1). В ходе подготовки nanoliposome решение показывает различные этапы в мутность (рис. 2).
<p class="jove_content" f...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA at JoVE.com

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Поколение катионного Nanoliposomes для эффективной доставки в Vitro транскрипции РНК

Здесь мы описываем протокол для поколения катионного nanoliposomes, который основан на методе сухой фильм и может использоваться для безопасного и эффективного предоставления в vitro транскрипции РНК.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Этот протокол позволяет производство безопасных и эффективных нанолипосом, которые могут быть использованы в качестве трансфекции транспортных средств для терапевтических РНК посыльного. Эти нанолипосомы облегчают поглощение мРНК в клетках, что приводит к повышению уровня экспрессии белка, не влияя на жизнеспособность клеток. Основным преимуществом этой техники является быстрое и легкое генерация стабильных нанолипосом с определенным размером и однородным распределением.Кроме того, они защищают инкапсулированную мРНК от деградации и приводят к длительному переводу. Демонстрацией процедуры будет Антония Линк, аспирант нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, подготовить фондовые растворы для липидов, DC-холестерина и DOPE путем растворения каждого в хлороформе до конечной концентрации 25 миллиграммов на миллилитр.Смешайте 40 микролитров растворенного DC-холестерина с 80 микролитров растворенного DOPE в стеклянной колбе. Испаряйте хлороформ под потоком аргона в течение 15 минут. Затем заполните децикатор кремнеземным гелем.Поместите открытую стеклянную колбу внутрь и нанесите вакуум на ночь, чтобы убедиться, что оставшийся хлороформ испаряется. Полученная липидная пленка сформируется внутри стеклянной колбы. На следующий день добавьте один миллилитр нуклеазы свободной воды для регидратации липидной пленки.И вихрь подвески в течение 15 минут. Поместите суспензию в звуковую ванну на один час. После этого соберите мини экструдер в соответствии с инструкциями производителей.Заполните шприц жидкой подвеской и поместите его с одной стороны экструдера. Поместите пустой шприц на другую сторону. Нажмите липидную суспензию через мембрану от одного шприца к другому, примерно 20-25 раз, чтобы выдавить подвеску.Затем храните нанолипосомы в стеклянной колбе при четырех градусах цельсия до готовности к использованию. Во-первых, разморозить синтетическую мРНК на льду. Vortex замороженных мРНК, а затем центрифуги его незадолго до открытия трубки.Затем смешайте один микрограмм синтетической мРНК с различным количеством нанолипосомной подвески. Центрифуга кратко и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут для формирования нанолипоплекса. Затем добавьте миллилитр обычной клеточной среды в нанолипоплекс и перемешайте с помощью трубок вверх и вниз.Подготовь клетки за день до трансфекции. Таким образом, пластина 150000 A549 клеток в каждый колодец из 12 пластины хорошо за день до трансфекции. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом и обычной клеточной средой в течение 24 часов.Затем на следующий день, мыть каждый колодец подготовленных клеток один раз с одним миллилитров PBS. Добавьте один миллилитр подготовленной нанолипоплексной смеси в одну из скважин, содержащих клетки A549. Инкубировать в обычных условиях в течение 24 часов, чтобы проанализировать эффективность трансфекции, или в течение 24-72 часов, чтобы проанализировать жизнеспособность клеток после трансфекции.Удалите супернатант и мыть каждый хорошо с одним миллилитров PBS, чтобы удалить оставшиеся нанолипосомы. Чтобы подготовить клетки к цитометрии, сначала добавьте 500 микролитров трипсина EDTA к каждой хорошо и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут, чтобы попробовать прояснизировать клетки. Затем добавьте 500 микролитров обычной FBS-содержащей среды, чтобы остановить процесс и инактивировать трипсин.Центрифуга клетки на 400 раз G в течение пяти минут. И осторожно удалить супернатант, не нарушая ячейки гранулы. Вымойте клетки одним миллилитром PBS.Затем повторно приостанавливают клетки в 300 микролитров раствора фиксации клеток и передают их в трубы цитометрии потока. Используйте цитометр потока для анализа клеток на 488 нанометров. Чтобы подготовить клетки к микроскопии флуоресценции, добавьте по миллилитр охлажденного метанола к каждому хорошо, чтобы исправить клетки.Добавьте 500 микролитров 300 наномолярных растворов DAPI, растворенных в PBS, в каждую колодец. Инкубировать в темноте в течение пяти минут. После этого удалите раствор DAPI и снова вымойте клетки 100%-ным метанолом, который ранее хранился при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Используйте флуоресцентный микроскоп для анализа клеток с помощью возбудивания и выбросов длин волн показано здесь. В этом исследовании нанолипосомы генерируются с высокой эффективностью инкапсуляции для синтетически модифицированной мРНК. Используя набор количественной оценки РНК, эффективность инкапсуляции нанолипосом можно проанализировать после инкапсуляции одного микрограмма eGFP, кодирующей мРНК, анализируя свободное количество мРНК, которое не инкапсулировано.После инкапсуляции EGFP mRNA в различных количествах нанолипосом, сформированные нанолипоплексы могут быть инкубированы клетками in vitro и процент eGFP-экспресс-экспрессии клеток может быть проанализирован с помощью цитометрии потока 24 часов после трансфекции. Как видно здесь, даже одного микролицера раствора нанолипосом достаточно для достижения высокой трансфекции клеток invitro. Когда клетки трансфицированы нанолипосомами, содержащими Cy3 помеченную eGFP mRNA, присутствие мРНК eGFP в цитоплазме, а также уже произведенный белок eGFP, можно визуализировать.Поскольку трансфекция клеток с использованием нанолипоплексов может оказывать неблагоприятное воздействие на клетки, жизнеспособность клеток была протестирована через 24 часа и 72 часа после трансфекции. Никакого влияния на жизнеспособность клеток не было обнаружено, когда клетки лечились 2,5 или пятью микролитров нанолипоплексов. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать в среде, свободной от этанола все время, потому что это может нанести ущерб нанолипосомной стабильности.При подготовке и смешивании DC-холестерина с DOPE, вы должны использовать стеклянную пипету, чтобы избежать загрязнения растворенных липидов с растворимыми компонентами пластиковых пипеток советы. Следуя этому протоколу, генерируемые нанолипосомы можно легко манипулировать во время или после подготовки. Например, включение молекул ПЕГ или специфических антител приведет к повышению стабильности или инициирует таргетинг активных тканей.Генерируемые нанолипосомы выполняют необходимые аспекты безопасности и облегчают поглощение мРНК в клетки-мишени. Нанолипосомы, сложные с конкретной терапевтической nRNA может внести существенный вклад в развитие новых мРНК основе терапии в области тканевой инженерии или заместительной терапии, например.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Микромасштабные Vortex-помощь электропоратора для последовательного молекулярной Доставка

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель дыхательных путях стены

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Доставки терапевтических миРНК в ЦНС с использованием катионных и анионных липосом

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Подготовка и характеристика нанолипосомы для захвата биоактивных гидрофильных глобулярных белков

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...