Name: generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00
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1. generación de nanoliposomas catiónico (figura 1)
<ol><li>Disolver los lípidos colesterol DC (3β-[-(N′,N′-dimethylaminoethane) de N-Carbamoil] colesterol clorhidrato) y DOPE (dioleoyl fosfatidiletanolamina), entregado en forma de polvo, en cloroformo para obtener una concentración final de 25 mg/mL. Nota: Almacenar los lípidos disueltos a-20 ° C.</li>
	<li>Trabajar con 25 mg/mL de solución stock de ambos lípidos. Mix 40 μl de la DC-colesterol disuelto y 80 μl de la drog...

El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfec...

El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.
Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5'-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.
Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.
Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.
Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.
En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.
Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.
Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.

Utilizando el protocolo como se describe, NLps consisten en los lípidos colesterol DC y la droga fueron preparados utilizando el método de película seca (figura 1). Durante la preparación, la solución nanoliposoma muestra diferentes etapas en turbidez (figura 2).
La eficacia de la encapsulación de la NLps luego puede ser analizada después de la encapsulación de ...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Este protocolo permite la producción de nanoliposomas seguros y eficientes que se pueden utilizar como vehículos de transfección para EL ARN mensajero terapéutico. Estos nanoliposomas facilitan la absorción de ARNm en las células, lo que resulta en un aumento de los niveles de expresión de proteínas sin afectar la viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica es la generación rápida y fácil de nanoliposomas estables con tamaño definido y distribución homogénea.Además, protegen el ARNm encapsulado de la degradación y conducen a una traducción prolongada. Demostrar el procedimiento estará Antonia Link, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, preparar soluciones de stock para los lípidos, COLESTEROL DC y DOPE disolviendo cada uno en cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro.Mezclar 40 microlitros del colesterol DC disuelto con 80 microlitros del DOPE disuelto en un matraz de vidrio. Vaporizar el cloroformo bajo un flujo de gas argón durante 15 minutos. A continuación, llene un desecador con gel de sílice.Coloque el matraz de vidrio abierto dentro y aplique un vacío durante la noche para asegurarse de que el cloroformo restante se evapora. La película lipídica resultante se formará dentro del matraz de vidrio. Al día siguiente, añadir un mililitro de agua libre de nucleasas para rehidratar la película lipídica.Y vórtice la suspensión durante 15 minutos. Coloque la suspensión en un baño de sonicación durante una hora. Después de esto, montar el mini extrusor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Llene una jeringa con la suspensión líquida y colóquela a un lado del extrusor. Coloque una jeringa vacía en el otro lado. Presione la suspensión de lípidos a través de la membrana de una jeringa a la otra, aproximadamente 20-25 veces para extruir la suspensión.A continuación, guarde los nanoliposomas en un matraz de vidrio a cuatro grados Centígrados hasta que estén listos para usar. Primero, descongela el ARNm sintético sobre hielo. Vórtice el ARNm congelado y luego centrifugarlo poco antes de abrir el tubo.A continuación, mezclar un microgramo del ARNm sintético con varias cantidades de suspensión nanoliposoma. Centrifugar brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para la formación de nanolipoplex. Luego, agregue mililitro de medio celular regular al nanolipoplex y mezcle pipeteando arriba y abajo.Prepare las células un día antes de la transfección. Por lo tanto, placa 150, 000 A549 células en cada poción de una placa de 12 pozos un día antes de la transfección. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un medio celular regular durante 24 horas.Luego, al día siguiente, lave cada pozo de células preparadas una vez con un mililitro de PBS. Añadir un mililitro de una mezcla de nanolipoplex preparada a uno de los pozos que contienen las células A549. Incubar en condiciones regulares durante 24 horas para analizar la eficiencia de la transfección, o durante 24-72 horas para analizar la viabilidad celular después de la transfección.Retire el sobrenadante y lave cada pozo con un mililitro de PBS para eliminar los nanolipomas restantes. Para preparar las células para la citometría, primero agregue 500 microlitros de trippsina EDTA a cada pozo e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos para probar las células. A continuación, agregue 500 microlitros de medio regular que contenga FBS para detener el proceso e inactivar la tripina.Centrifugar las células a 400 veces G durante cinco minutos. Y retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Lave las células con un mililitro de PBS.Luego vuelva a suspender las células en 300 microlitros de solución de fijación celular y transfiéralas a tubos de citometría de flujo. Utilice un citómetro de flujo para analizar las células a 488 nanómetros. Para preparar las células para la microscopía de fluorescencia, agregue un mililitro de metanol refrigerado a cada pozo para fijar las células.Añadir 500 microlitros de una solución nanomolar 300 de DAPI disuelta en PBS a cada pozo. Incubar en la oscuridad durante cinco minutos. Después de esto, retire la solución DAPI y lave las células de nuevo con 100%metanol que se almacenó previamente a menos 20 grados Celsius.Utilice un microscopio de fluorescencia para analizar las células utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión que se muestran aquí. En este estudio, los nanoliposomas se generan con alta eficacia de encapsulación para el ARNm modificado sintéticamente. Utilizando el kit de cuantificación de ARN, la eficacia de encapsulación de los nanoliposomas se puede analizar después de la encapsulación de un microgramo de ARNm de codificación eGFP mediante el análisis de la cantidad libre de ARNm que no está encapsulado.Después de la encapsulación de EGFP mRNA en diferentes cantidades de nanoliposomas, los nanolipoplexos formados se pueden incubar con células in vitro y el porcentaje de células que expresan eGFP se puede analizar utilizando citometría de flujo 24 horas después de la transfección. Como se ve aquí, incluso un microlitro de la solución de nanoliposomas es suficiente para lograr una alta transfección de las células invitro. Cuando las células se trans infectan con nanoliposomas que contienen mRNA eGFP etiquetada Cy3, se puede visualizar la presencia del ARNm eGFP en el citoplasma, así como la proteína eGFP ya producida.Dado que la transfección de células que utilizan nanolipoplexos puede tener efectos adversos en las células, la viabilidad de las células se probó después de 24 horas y 72 horas después de la transfección. No se pudieron detectar efectos sobre la viabilidad celular cuando las células fueron tratadas con 2,5 o cinco microlitros de nanolipopplexos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en un ambiente libre de etanol todo el tiempo porque esto podría dañar la estabilidad de los nanoliposomas.Mientras prepara y mezcla el colesterol DC con DOPE, debe utilizar una pipeta de vidrio para evitar la contaminación de los lípidos disueltos con componentes solubles de las puntas de pipeta de plástico. Siguiendo este protocolo, los nanoliposomas generados se pueden manipular fácilmente durante o después de la preparación. Por ejemplo, la incorporación de moléculas de PEG o anticuerpos específicos conduciría a una mayor estabilidad o iniciaría la orientación activa del tejido.Los nanoliposomas generados cumplen los aspectos de seguridad necesarios y facilitan la absorción de ARNm a las células diana. Los nanoliposomas complejos con un NRNA terapéutico específico pueden hacer una contribución esencial al desarrollo de nuevas terapias basadas en ARNM en el campo de la ingeniería de tejidos o la terapia de reemplazo, por ejemplo.

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