Name: isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart at JoVE.com

Questo lavoro è supportato, in parti, dalle sovvenzioni National Institutes of Health HL-113281 e HL116205 a. punti Kumar Mishra.

L'alloggiamento, l'anestesia e sacrificio dei topi sono stati effettuati seguendo il protocollo approvato IACUC dell'University of Nebraska Medical Center.
1. materiali
<ol><li>Uso 10 a 12-week-old C57BL/6J nero topi maschi, mantenuti in-House presso l'impianto istituzionale degli animali, per l'isolamento delle CSCs. CSCs possono anche essere isolate da topi femmine non gravide.</li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari, tra cui forbici chirurgiche, bene forbici chirur...

<ol>
	<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146 (2017).</li><li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure,+2000+to+2016:+A+Systematic+Review.">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li><li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model.">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li><li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure.">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li><li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+heart+failure:+Ensuring+regenerative+proficiency.">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy.">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li><li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration.">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li><li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracoronary+CD34++stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients:+5-year+follow-up.">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li><li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy:+the+POSEIDON+randomized+trial.">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li><li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+transplantation+of+mesenchymal+stromal+cells+for+chonic+myocardial+ischemia+and+impaired+left+ventricular+function:+Results+of+the+MESAMI+1+pilot+trial.">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function,+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction.">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li><li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease.">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+infusion+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction:+double-blind,+randomized+controlled+trial.">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162 (2015).</li><li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts.">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li><li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-kit(+)+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload.">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease:+role+of+exosomal+microRNA+transfer.">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li><li>Sahoo, S., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114, 333-344 (2014).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+Cardiac+Stem+Cells+With+Exosomes+Derived+From+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Myocardial+Repair.">Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair.</a> Journal of the American Heart Association. 5, (2016).</li><li>Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy.">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li><li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+exosomal+miRNAs+in+cardiovascular+protection+and+repair.">Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair.</a> Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).</li><li>Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+cell+therapy:+lessons+from+clinical+trials.">Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).</li><li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials:+Progress+and+Challenges.">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li><li>Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1(+)+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration.">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265 (2011).</li><li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+cardiac+stem+cell+therapy:+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types.">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).</li><li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart:+Blind+Alley+or+Magic+Bullet?.">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li><li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+success+in+heart+failure:+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases.">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li><li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit++Cardiac+Progenitor+Cells.">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li><li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit++Sca-1++CXCR4++resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal,+postnatal,+and+adult+mouse+heart.">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li><li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy.">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li><li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles.">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li><li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs.">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li><li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenic+potential+of+C-kit(+)-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts.">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1+/CD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue.">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li></ol>

I punti critici di questo protocollo di isolamento del CSC sono come segue. 1) una condizione sterilizzata deve essere mantenuta per l'estrazione dei cuori dai topi. Qualsiasi contaminazione durante l'estrazione del cuore può compromettere la qualità della CSC. 2) il sangue deve essere completamente rimosso prima di tritare il cuore, che è fatto da diversi lavaggi di tutto il cuore e il cuore a pezzi con soluzione HBSS. 3) i pezzi di cuore devono essere completamente lisati in sospensione unicellulare con soluzione de...

Cardiopatia ischemica, tra cui l'infarto miocardico (MI), è delle principali cause di morte intorno al mondo1. Terapia con cellule staminali per la rigenerazione del miocardio morto rimane un approccio importante per migliorare la funzione cardiaca di un MI cuore2,3,4,5. Diversi tipi di cellule staminali sono stati utilizzati per ricostituire il miocardio morto e migliorare la funzione cardiaca di un cuore MI. Essi possono essere categorizzati largamente in cellule staminali embrionali di6 e adulto di cellule staminali. In cellule staminali adulte, sono stati utilizzati vari tipi di cellule staminali, ad esempio cellule mononucleari derivate da midollo osseo7,8, cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo9,10, tessuto adiposo 11,12e del cordone ombelicale13e CSCs14,15. Le cellule staminali possono promuovere rigenerazione cardiaca attraverso endocrine e/o paracrino azioni16,17,18,19,20. Tuttavia, una limitazione importante della terapia con cellule staminali è l'ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali che possono proliferare e differenziarsi verso una specifica linea cardiaca21,22. Trapianto autologo e allogenico di cellule staminali è una sfida importante in cellule staminali terapia9. CSCs potrebbe essere un approccio migliore per la rigenerazione cardiaca perché sono derivati dal cuore e possono essere più facilmente differenziati in cardiaci lignaggi di cellule staminali non-cardiaca. Quindi, riduce il rischio di teratoma. Inoltre, gli effetti endocrino e paracrino delle CSCs, quali esosomi e Mirna derivati da CSCs, potrebbero essere più efficaci rispetto ad altri tipi di cellule staminali. Così, CSCs rimane un'opzione migliore per la rigenerazione cardiaca23,24.
Anche se CSC sono un candidato migliore per la rigenerazione cardiaca in un cuore MI dovuto la loro origine cardiaca, una limitazione importante con CSC è meno resa a causa della mancanza di un metodo efficiente isolamento. Un'altra limitazione potrebbe essere alterata differenziazione delle CSCs verso cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Per ovviare a queste limitazioni, è importante sviluppare un efficiente protocollo per isolamento, caratterizzazione e differenziamento verso la linea cardiaca CSC. Non c'è nessun singolo indicatore accettabile per CSCs e un isolamento specifico di basati su marcatore cellula-superficie di CSCs produce meno CSCs. Qui, abbiamo standardizzare un approccio semplice centrifugazione su gradiente per isolare CSCs dal cuore del mouse che è conveniente e si traduce in un maggiore rendimento di CSCs. Questi CSCs isolato è selezionabile per specifici marcatori di superficie cellulare di corto circuito di fluorescenza-attivato delle cellule. Oltre all'isolamento di CSCs, abbiamo fornito un protocollo per cultura CSC, caratterizzazione e differenziamento verso cardiomyocyte lignaggio. Così, vi presentiamo un metodo elegante per isolare, caratterizzare, cultura e differenziare CSCs da cuori di topo adulto (Figura 5).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson laboratory, USA</td>
			<td>Stock no. 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4-</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18976 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80892 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16667 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB4336 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8697 (goat polyclonal)</td>
			<td>NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84593 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEF2C</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-13268 (goat polyclonal)</td>
			<td>MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troponin I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1691 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1682 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5490 (mouse polyclonal)</td>
			<td>ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 rabbit anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-mouse</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 checken anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSC maintenance medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM101</td>
			<td>Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cardiomyocytes differentiation medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Isolation buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2018-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>S1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal checken serum</td>
			<td>Vector laboratory</td>
			<td>S3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A100,0010</td>
			<td>Dapi, working concentration-1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>Cas No. 900-293-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Sceintific</td>
			<td>Lot No. 160170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syring</td>
			<td>BD</td>
			<td>Ref no. 309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrufuge machine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LEGEND X1R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS microscope</td>
			<td>Life technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippte aid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curve shank forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart

Infarto miocardico (MI) è delle cause principali di morbilità e mortalità nel mondo. Degli obiettivi principali della medicina rigenerativa è per ricostituire il miocardio morto dopo MI. Anche se diverse strategie sono state utilizzate per rigenerare il miocardio, terapia con cellule staminali rimane un approccio importante per ricostituire il miocardio morto di un cuore MI. Raccogliendo la prova suggerisce la presenza di cellule staminali residenti cardiache (CSCs) nel cuore adulto e loro effetti endocrini o paracrino sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, CSC isolamento e loro caratterizzazione e differenziazione verso le cellule del miocardio, soprattutto cardiomiociti, rimane una sfida tecnica. Nello studio presente, abbiamo fornito un metodo semplice per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di CSCs dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo del gradiente di densità per l'isolamento delle CSCs, dove il cuore è digerito da una soluzione di 0,2% collagenosi II. Per caratterizzare le CSCs isolate, abbiamo valutato l'espressione di marcatori di CSCs/cardiaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcatori di pluripotenza/staminalità OCT4, SOX2 e Nanog. Inoltre abbiamo determinato il potenziale di proliferazione di CSCs isolato messa in coltura in una capsula di Petri e valutando l'espressione del marker di proliferazione Ki-67. Per valutare il potenziale di differenziazione delle CSCs, abbiamo selezionato sette - dieci - giorni coltivate CSCs. Li abbiamo trasferito in una nuova piastra con un mezzo di differenziazione dei cardiomiociti. Essi vengono incubati in un'incubatrice di coltura cellulare per 12 giorni, mentre il mezzo di differenziazione viene cambiato ogni tre giorni. Le CSCs differenziate esprimono marcatori del cardiomyocyte specifiche: actinina e troponina I. Così, CSCs isolato con questo protocollo dispone di staminalità e marcatori cardiaci, e hanno un potenziale di proliferazione e differenziazione verso cardiomyocyte lignaggio.

Nello studio presente, abbiamo isolato il CSCs da cuori di topo maschio di 10 a 12-week-old C57BL/6J. Qui, abbiamo presentato un metodo semplice per CSC isolamento e caratterizzazione mediante marcatori di pluripotenza. Abbiamo anche presentato un metodo elegante per il differenziamento di CSC e la caratterizzazione delle CSCs che differenziati verso cardiomyocytes lignaggio. Abbiamo osservato una morfologia di forma dell'alberino di CSCs 2 - a 3-giorni-coltivati sotto un microscopio a co...

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Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

L'obiettivo generale di questo articolo è standardizzare il protocollo per l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali cardiache, CSC dal cuore del topo adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, nel campo delle malattie cardiovascolari e della terapia regionale come la terapia con cellule staminali cardiache e l'insufficienza cardiaca. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è conveniente, con un aiuto elevato in un piccolo periodo di tempo.Inizia questo esperimento preparando tutti i materiali, gli strumenti e i buffer di isolamento necessari in una condizione sterilizzata come descritto nel protocollo. Dopo aver rimosso la pelle dall'addome di un topo eutanasiato, tagliare la gabbia toracica all'interno del cappuccio sterile per aprire la cavità toracica. Esporre il cuore e quindi rimuovere il sangue vicino al cuore usando una siringa millilitro.Per rimuovere il sangue vicino al cuore, lavare l'area circostante con PBS ghiacciato. Usando forbici chirurgiche e pinzette per sezionare il cuore, posizionarlo in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente PBS ghiacciato da 10 millilitri. Usa le flesse curve del gambo per palpitare il cuore e rimuovere il sangue residuo all'interno del cuore.Trasferire da quattro a cinque cuori isolati in una piastra di Petri da 100 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione salina equilibrata del prosciutto ghiacciato. Palpare di nuovo i cuori per lavarli e rimuovere il sangue residuo all'interno del cuore. Per garantire la completa rimozione del sangue, cambiare la soluzione HBSS dopo ogni lavaggio.Tenere ogni cuore con un paio di forcep e utilizzare una lama chirurgica per tagliare ogni cuore in pezzi da due a quattro millimetri in una piastra di Petri da 100 millimetri, contenente da cinque a sette millilitri di HBSS. Cambiare frequentemente la soluzione per garantire la completa rimozione del sangue. Infine, tritare i cuori nella soluzione HBSS.Centrifugare i cuori tritati posti in un tubo conico da 50 millilitri a 500 volte G, a quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il supernatante. Aggiungere da cinque a sei millilitri, soluzione di collagenasi II allo 0,2% al pellet per digerire il tessuto. Sospendere completamente il pellet dondolando il tubo su uno shaker a 75 volte G, a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.Ogni 20-30 minuti, agitare vigorosamente il tubo a mano per esaltare lalisi. Triturare la miscela di tessuti lisciviati utilizzando pipetta sierologica da cinque millilitri e una punta di pipetta millilitro per dissociare il grumo tissutale nella sospensione a singola cellula. Per interrompere la llisi enzimatica del tessuto, aggiungere da due a tre volte il mezzo di manutenzione CSC disponibile in commercio come il volume del tessuto lassato.Passare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare di 100 micrometri posto su un tubo conico da 50 millilitri per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non digeriti. Per separare le cellule dalla centrifugazione gradiente di densità, aggiungere 37 gradi Celsius, soluzione prerifuricata, polisucrose e diatrizoato di sodio a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere delicatamente e lentamente un uguale volume di filtrato sulla soluzione, evitando qualsiasi miscelazione delle due soluzioni.È fondamentale aggiungere lentamente il filtrato su polisucrose e soluzione di diatrizoato di sodio senza mescolare inclinando il tubo a 45 gradi e contro la parete del tubo. Non aggiungere polisucrose e soluzione di diatrizoato di sodio su filtrato. Posizionare il tubo molto lentamente in una centrifuga a benna oscillante assicurandosi di non disturbare le soluzioni.Centrifuga a 500 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente impostata a una velocità di accelerazione e decelerazione inferiore per evitare di mescolare le due soluzioni e per una corretta separazione delle cellule staminali cardiache. È fondamentale mettere la soluzione gradiente con molta attenzione senza disturbi nella centrifuga. Mettere l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga deve essere alla velocità più bassa, ad esempio una o zero.Utilizzare una pipetta di un millimetro per trasferire il mantello buffy contenente i CSC insieme a una soluzione extra dallo strato superiore a un tubo sterilizzato da 15 millilitri. Aggiungere un volume uguale di mezzo di manutenzione CSC e mescolarlo correttamente per neutralizzare la soluzione residua di polisucrose e diatrizoato di sodio. Centrifuga questa sospensione a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il supernatante. Ripetere il lavaggio dei CSC con soluzione DMEM incompleta almeno per due volte. Centrifuga a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per sbarazzarsi di qualsiasi soluzione residua di polisucrose e diatrizoato di sodio.Dopo aver rimosso il supernatante, rimescolare il pellet contenente CSC purificati in un mezzo di manutenzione CSC millilitro, quindi contare le cellule. Sezionare i CSC in una piastra di coltura a sei pozzi rivestita con una soluzione di gelatina allo 0,02% contenente lo 0,5% di fibronectina e aggiungere due millilitri di mezzo di manutenzione completo. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in 5%CO2.Quando la coltura CSC raggiunge la confluenza, trasferire le cellule in una nuova piastra rivestita di gelatina e fibronectina come descritto nel protocollo di testo. Coltura questi CSC P0 trasferiti in un mezzo di manutenzione CSC completo a 37 gradi Celsius in un incubatore di CO2 al 5% fino a confluenza. Ripetere il trasferimento della cella su una nuova piastra per creare CSC P1 che possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti.Per mantenere le impostazioni cultura CSC nella fase iniziale, seminare ulteriormente le celle come descritto nel protocollo di testo. Per caratterizzare le cellule coltivate, posizionare la piastra contenente CSC sull'obiettivo di un microscopio fluorescente. Utilizzare dieci volte l'ingrandimento per mettere a fuoco le celle.Per osservare le celle, usate l'apertura a contrasto di fase e aumentate l'ingrandimento a 20 volte modificando l'obiettivo, quindi immaginiamo i CSC. Dopo aver eseguito l'immunostaining, posizionare la piastra di coltura al microscopio a fluorescenza. Mettere a fuoco le celle con ingrandimenti diversi e osservare le celle in contrasto di fase e diversi filtri di eccitazione e salvare le immagini.Per la differenziazione cellulare, far crescere i CSC in una piastra a sei porsi con due millilitri di 37 gradi Celsius, mezzo di manutenzione CSC pre-riscaldato. Quando le cellule raggiungono l'80-95% di confluenza, sostituire il mezzo di manutenzione con due millilitri, 37 gradi Celsius, mezzo di differenziazione dei cardiomiociti pre-riscaldato. Incubare a 37 gradi Celsius, in una CO2 del 5% per un massimo di due o tre settimane.Cambiare il mezzo di differenziazione ogni due o tre giorni. Durante il cambiamento medio, osservare la morfologia cellulare al microscopio per garantire le buone condizioni di coltura. Dopo 12 giorni, immagini le cellule per marcatori di differenziazione seguendo un protocollo standard di immunosottenzione.I CSC coltivati da due a tre giorni mostrano una morfologia a forma di mandrino quando osservati al microscopio a contrasto di fase. Dopo sette giorni di cultura, mostrano un cambiamento nella morfologia che si allunga. Dopo l'immunosottenzione per marcatori di pluripotenza, i CSC mostrano espressioni di OCT4, SOX2 e Nanog.Inoltre, i CSC proliferano nel mezzo di coltura ed esprimono il marcatore di proliferazione Ki67. Per caratterizzare l'origine cardiaca dei CSC, è stata esaminata l'espressione dei marcatori cardiaci e le cellule si sono dimostrate positive per i marcatori cardiaci Sca-1, NKX2.5 e GATA4. Dopo aver coltivato nel mezzo di differenziazione dei cardiomiociti per 12 giorni, i CSC differenziati mostrano l'espressione dei marcatori di cardiomiociti ACTININ e TROPONIN-I.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non consentire la miscelazione della soluzione gradiente e del filtrato. È anche importante impostare l'accelerazione e la decelerazione alla velocità più bassa. Chiunque li contamini, si consiglia di eseguire tutti i processi di isolamento cellulare all'interno di un armadio di biosicurezza.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la separazione a base di perline magnetiche o i metodi di smistamento delle cellule a base citometica a flusso al fine di rispondere a domande aggiuntive quali, quanto è chiara la popolazione omogenea di cellule staminali cardiache? Il raggio di crack in una cellula staminale cardiaca è un grande marcatore, e ci sono differenze verso i cardiomiociti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo delle malattie cardiovascolari che spesso hanno un alto rendimento di cellule staminali cardiache dal cuore del topo che potrebbe essere importante per la terapia rigenerativa in insufficienza cardiaca ischemica.Non dimenticare che lavorare con lama chirurgica, candeggina e DMSO può essere pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione del personale, DPI, devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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