Name: isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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この作業は、パーツでサポート、HL 113281 とパラス ・ クマール ・ ミシュラに HL116205 国立衛生研究所の助成金によって。

住宅、麻酔科とマウスの犠牲をネブラスカ大学医療センターの承認された IACUC プロトコルに従って行った。
1. 材料
<ol><li>オスの鼠の動物機関 CSCs。 CSCs を分離するために社内保管することができますも使用 10-12 週齢 c57bl/6 j ブラックは非妊娠したメスマウスから分離されます。</li>
	<li>オートクレーブに入れることによって外科はさみ、微細手術用はさみ、湾曲したシ?...

<ol>
	<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146 (2017).</li><li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure,+2000+to+2016:+A+Systematic+Review.">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li><li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model.">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li><li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure.">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li><li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+heart+failure:+Ensuring+regenerative+proficiency.">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy.">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li><li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration.">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li><li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracoronary+CD34++stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients:+5-year+follow-up.">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li><li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy:+the+POSEIDON+randomized+trial.">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li><li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+transplantation+of+mesenchymal+stromal+cells+for+chonic+myocardial+ischemia+and+impaired+left+ventricular+function:+Results+of+the+MESAMI+1+pilot+trial.">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function,+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction.">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li><li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease.">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+infusion+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction:+double-blind,+randomized+controlled+trial.">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162 (2015).</li><li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts.">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li><li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-kit(+)+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload.">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease:+role+of+exosomal+microRNA+transfer.">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li><li>Sahoo, S., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114, 333-344 (2014).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+Cardiac+Stem+Cells+With+Exosomes+Derived+From+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Myocardial+Repair.">Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair.</a> Journal of the American Heart Association. 5, (2016).</li><li>Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy.">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li><li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+exosomal+miRNAs+in+cardiovascular+protection+and+repair.">Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair.</a> Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).</li><li>Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+cell+therapy:+lessons+from+clinical+trials.">Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).</li><li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials:+Progress+and+Challenges.">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li><li>Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1(+)+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration.">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265 (2011).</li><li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+cardiac+stem+cell+therapy:+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types.">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).</li><li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart:+Blind+Alley+or+Magic+Bullet?.">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li><li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+success+in+heart+failure:+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases.">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li><li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit++Cardiac+Progenitor+Cells.">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li><li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit++Sca-1++CXCR4++resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal,+postnatal,+and+adult+mouse+heart.">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li><li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy.">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li><li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles.">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li><li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs.">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li><li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenic+potential+of+C-kit(+)-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts.">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1+/CD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue.">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li></ol>

この CSC の隔離のプロトコルの重要な手順は次のとおりです。1) 滅菌条件は、マウスから心の抽出のために維持されなければなりません。心抽出中に汚染が CSCs。 2 の品質を危険にさらす) ミンチ入りの HBSS ソリューション全体の心と心のいくつかの洗浄によって行われる心の前に血を完全に削除する必要があります。3) 心の部分は、コラゲナーゼの解決と単一細胞懸濁液に完全に分離する必?...

虚血性心臓病、心筋梗塞 (MI) などは世界の1のまわりの死の主要な原因です。死んだ心筋を再生のための幹細胞療法のまま、MI の心2,の3,4、5の心機能を改善するために主要なアプローチです。異なったタイプの幹細胞は、死んだ心筋を補充するために、俺の心の心機能を改善するために使用されています。胚性幹細胞6と成人幹細胞に大きく分類することができます。大人の幹細胞の骨髄由来単核細胞7、8骨髄9,10,脂肪組織由来間葉系幹細胞などさまざまな種類の幹細胞を使用しているされて11,12、および臍帯13、CSCs14,15。幹細胞は、内分泌やパラクリン アクション16,17,18,19,20による心筋再生を昇格できます。しかし、幹細胞療法の主要な制限が増殖したり、特定の心臓系統21,22の方向へ分化する幹細胞の十分な数を取得します。自家および同種幹細胞移植は幹細胞療法9で重要な課題です。CSCs は、中心部から派生しているため、彼らすることができますより簡単に区別する心臓系統に非心臓幹細胞よりも心臓再生のためのより良いアプローチにかもしれない。したがって、奇形のリスクが軽減されます。また、エクソソームなど、CSCs から派生した Mirna CSCs の内分泌とパラクリンの効果は幹細胞の他のタイプよりも効果的かもしれません。従って、CSCs 残る心臓再生23,24のためのより良いオプションです。
CSCs は心臓起源のため MI 心心筋再生に適して、CSCs の主要な制限は効率的な分離方法の不足のため以下の収量。別の制限は、心筋細胞系列2,25,26,27に向かって CSCs の障害者差別化で可能性があります。これらの制限を回避するために CSC の分離、特性評価、心臓系統への分化に効率的なプロトコルを開発することが重要です。CSCs の単一の許容可能なマーカーがない、CSCs の特定細胞表面マーカーに基づく分離が少ない CSCs を得られます。ここでは、費用対効果は、CSCs の増加収量結果マウス心臓から CSCs を分離するための単純な勾配遠心法アプローチを標準化します。これらの孤立した CSCs は、蛍光活性化細胞を短絡すること特定の細胞表面マーカーの選択できます。CSCs の分離に加えて CSC 文化、特性評価、心筋細胞系列への分化にプロトコルを提供します。したがって、分離し、文化を特徴付ける成体マウスの心 (図 5) から CSCs を区別するエレガントな方法を提案する.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson laboratory, USA</td>
			<td>Stock no. 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4-</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18976 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80892 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16667 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB4336 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8697 (goat polyclonal)</td>
			<td>NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84593 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEF2C</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-13268 (goat polyclonal)</td>
			<td>MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troponin I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1691 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1682 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5490 (mouse polyclonal)</td>
			<td>ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 rabbit anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-mouse</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 checken anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSC maintenance medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM101</td>
			<td>Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cardiomyocytes differentiation medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Isolation buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2018-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>S1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal checken serum</td>
			<td>Vector laboratory</td>
			<td>S3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A100,0010</td>
			<td>Dapi, working concentration-1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>Cas No. 900-293-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Sceintific</td>
			<td>Lot No. 160170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syring</td>
			<td>BD</td>
			<td>Ref no. 309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrufuge machine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LEGEND X1R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS microscope</td>
			<td>Life technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippte aid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curve shank forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart

心筋梗塞 (MI) は、罹患率と世界中の死亡の主要な原因です。再生医療の主な目的は、MI 後死んだ心筋を補充するためにです。いくつかの戦略は、心筋を再生する使用されている幹細胞療法まま俺の心死んだ心筋を補充するために主要なアプローチになります。成人の心臓と心筋再生に内分泌やパラクリン効果で居住者心臓幹細胞 (CSCs) の存在を示唆証拠の蓄積します。しかし、CSC 分離特性と特に心筋心筋細胞へ分化技術的課題が残っています。本研究では分離と性質、CSCs の成体マウスの心から差別化の簡単な方法を提供します。ここでは、CSCs、0.2% コラゲナーゼ II ソリューションによって心を消化する場所の隔離のための濃度勾配法について述べる。分離 CSCs を特徴付ける、CSCs/心臓マーカー Sca 1、NKX2-5、および、GATA4 および多能性/未分化マーカー OCT4、SOX2, Nanog の発現を評価しました。シャーレで培養増殖マーカー Ki 67 の式を評価することにより分離 CSCs の拡散可能性も決定。CSCs の微分の潜在性を評価するため、我々 は 7 に 10 日間培養 CSCs を選択しました。我々 は心筋細胞分化培地と新しいプレートにそれらを転送します。彼らは 12 日細胞文化のインキュベーターで培養分化培地は 3 日ごとに変更中。差別化された CSCs エクスプレス心筋細胞特異的マーカー: アクチニンとトロポニン私。したがって、このプロトコルで分離された CSCs ある未分化と心臓マーカー、増殖や心筋細胞系列へ分化する可能性があります。

本研究では 10-12 週齢の c57bl/6 j マウス雄心から CSCs を分離しました。ここでは、簡易 CSC 分離と多能性マーカーを用いた評価法を提案しました。また、CSC 分化のエレガントな方法と心筋細胞系統に分化した CSCs の評価を発表しました。(図 1 aと1 b) 位相差顕微鏡下で 2 に 3-日-培養 CSCs の紡錘形形態を観察した.幹細胞になる時間の間?...

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Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC の精緻な方法について述べる。

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

この記事の全体的な目標は、心臓幹細胞の分離、特性評価、および分化のためのプロトコルを標準化することです, 大人マウス心臓からのCSC.この方法は、心血管疾患および心臓幹細胞療法および心不全などの地域療法の分野における主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、それが時間の小さな期間で高い援助と、費用対効果が高いということです。プロトコルに記載されているように、滅菌状態で必要なすべての材料、器具、および分離バッファーを準備することによって、この実験を開始します。安楽死させたマウスの腹部から皮膚を取り除いた後、胸腔を開くために滅菌フードの内側の胸部を切る。心臓を露出し、1ミリリットルの注射器を使用して心臓の近くの血液を除去します。心臓の近くで血液を除去するには、氷冷PBSで周囲を洗います。手術用ハサミとピンセットを使用して心臓を解剖し、10ミリリットルの氷冷PBSを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。湾曲したシャンク鉗子を使用して心臓を触診し、心臓の中の残留血液を取り除きます。氷冷ハムのバランス塩溶液の10ミリリットルを含む100ミリリットルのペトリ皿に4〜5つの孤立した心臓を転送します。それらを洗浄し、心臓の中に残っている血液を除去するために再び心臓を触診します。血液を完全に除去するには、洗浄後HBSS溶液を交換してください。各心臓を鉗子で保持し、外科用ブレードを使用して、HBSSの5〜7ミリリットルを含む100ミリメートルペトリ皿の2〜4ミリメートルの部分に各心臓を切断します。多くの場合、完全な脱退を確実にするためにソリューションを変更します。最後に、HBSSソリューションの心臓を軽視します。500倍Gの50ミリリットル円錐管に入れた細心を5分間摂氏4度で遠心し、上清を捨てる。5~6ミリリットル、0.2%コラゲターゼII溶液をペレットに加え、組織を消化します。75倍G、摂氏37度で45〜60分間シェーカーでチューブを揺らすことによって、ペレットを完全に再懸濁させます。20~30分ごとに、チューブを手で激しく振り、ライシスを高めます。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、1ミリリットルのピペットチップを使用して、単一細胞懸濁液中に組織塊を解化するために、リセド組織混合物をトリチュレートする。組織の酵素的リシスを停止するには、市販のCSC維持培地を、その組織の体積の2〜3倍加える。消化した細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐チューブに置いた100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、未消化の組織片を取り除きます。細胞を密度勾配遠心分離に分離するには、摂氏37度、あらかじめ温め、ポリスクロース、ジアトリゾートナトリウム溶液を50ミリリットル円錐形チューブに加えます。その後、穏やかにゆっくりと溶液の上に濾液の等量を追加し、2つの溶液の混合を避けます。ポリスクロースとナトリウムジアトリゾエート溶液の上に濾液を加えて、チューブを45度で、チューブの壁に対して傾けることなくゆっくりと添加することが重要です。濾液の上にポリスクロースとナトリウム珪藻酸溶液を追加しないでください。スイングバケット遠心分離機にチューブをゆっくりと置き、溶液を乱さないようにします。2つの溶液を混合することを避けるために、そして心臓幹細胞の適切な分離のために、より低い加速および減速速度で設定された室温で20分間Gの500倍の500倍の遠心分離。遠心分離機に乱れることなく、勾配溶液を非常に慎重に置くことが重要です。遠心分離機の加速と減速は、1または0などの最低速度でなければなりません。1ミリメートルのピペットを使用して、CSCを含むバフィーコートを上層から15ミリリットルの滅菌チューブに余分な溶液と一緒に移します。等量のCSC維持培地を加え、適切に混合して残留ポリスクロースと珪藻酸ナトリウム溶液を中和します。この懸濁液を500倍Gで摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨てます。少なくとも2回、不完全なDMEM溶液でCSCの洗浄を繰り返します。500倍Gで500倍の摂氏4度で5分間遠心分離機を使用して、残留ポリスクロースおよびナトリウムジアトリゾート溶液を取り除く。上清を除去した後、精製したCSCを含むペレットを1ミリリットルCSC維持培地に再懸濁し、次いで細胞をカウントする。CSCを0.5%フィブロネクチンを含む0.02%ゼラチン溶液でコーティングした6ウェル培養プレートに播種し、完全な維持培地を2ミリリットル加えます。5%CO2で摂氏37度で細胞を成長させます。CSC培養が合流性に達したら、テキストプロトコルに記載されているように、新しいゼラチンおよびフィブロネクチンコーティングプレートに細胞を移す。これらを培養して、コンフルエントになるまで5%CO2インキュベーターで37°Cの完全なCSC維持培地でP0 CSCsを培養した。新しいプレートへのセル転送を繰り返し、さらなる実験に使用できるP1 CSCを作成します。CSC 培養を初期段階で維持するには、テキスト プロトコルに記述されているように、さらにセルをシードします。培養細胞を特徴付けるには、CSC含有プレートを蛍光顕微鏡の目的に置きます。細胞に焦点を合わせるには、10倍の倍率を使用します。細胞を観察するには、位相差開口を使用し、対物レンズを交換して倍率を20倍に増やしてから、CSCを画像化します。免疫染色を行った後、培養プレートを蛍光顕微鏡下に置く。異なる倍率で細胞を焦点を合わせ、位相コントラストと異なる励起フィルタの下で細胞を観察し、画像を保存します。細胞分化のために、37°Cの2ミリリットル、事前に温めたCSC維持媒体を備えた6ウェルプレートでCSCを成長させます。細胞が80〜95%の合流度に達したら、維持培地を2ミリリットル、摂氏37度、あらかじめ温めた心筋細胞分化培地に交換してください。摂氏37度で、最大2〜3週間5%CO2でインキュベートします。分化培地を2~3日ごとに変更します。培地変化の間、細胞形態を顕微鏡で観察し、良好な培養条件を確保する。12日後、標準的な免疫染色プロトコルに従って分化マーカーの細胞を画像化します。培養CSCは、2〜3日間、位相対照顕微鏡で観察した場合に紡錘形の形態を示す。7日間の文化の後、彼らは形態の変化が細長くなることを示す。多能性のマーカーに対する免疫染色後、CSCはOCT4、SOX2、およびNanogの表現を示す。さらに、CSCは培養培地中で増殖し、増殖マーカーKi67を発現する。CSCの心臓起源を特徴付けるために、心臓マーカーの発現を調べ、心臓マーカーSca-1、NKX2.5、およびGATA4について陽性であることが細胞に示された。心筋細胞分化培地で12日間培養した後、分化CSCは、アクチニン、およびトロポニン-Iの心筋細胞マーカーの発現を示す。この手順を試みる際には、勾配溶液と濾液の混合を許可しないように注意することが重要です。加速度と減速を最低速度に設定することも重要です。それらを汚染する人は誰でも、バイオセーフティキャビネット内のすべての細胞分離プロセスを実行することをお勧めします。この手順に従って、磁気ビーズベースの分離やフローサイトメティック細胞のソート方法のような他の方法は、心臓幹細胞の均質な集団がどのくらい明確であるかなどの追加の質問に答えるために行うことができます。心臓幹細胞のクラック半径は大きなマーカーであり、心筋細胞に対する違いがあります。開発後、この技術は、虚血性心不全の再生療法に重要であり得るマウス心臓からの心臓幹細胞の高収量が多い心血管疾患の分野の研究者のための道を開くだろう。外科用ブレード、漂白剤、DMSOを使用することは危険であり、この手順を実行している間は、常に人事保護具、PPEを使用するなどの予防措置を取るべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...