Name: isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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이 작품에서에서 지원 됩니다, 부품, HL-113281 및 HL116205 성명서 쿠마 Mishra에 건강의 국가 학회 교부 금에 의해.

주택, 마 취, 그리고 마우스의 희생은 네브라스카 대학 의료 센터의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 하는 것을 수행 했다.
1입니다. 자료
<ol><li>사용 10-에 12 주 된 C57BL/6J 블랙 남성 쥐, CSCs CSCs의 격리에 대 한 제도적 동물 시설에서 사내 보관 수도 비 임신 여성 쥐에서 격리 되어야.</li>
	<li>모든 필요한 수술 악기, 수술가 위, 등 정밀한 수술가 위, 곡선된 칼 집게, 외과 블레이드, ?...

<ol>
	<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146 (2017).</li><li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure,+2000+to+2016:+A+Systematic+Review.">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li><li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model.">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li><li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure.">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li><li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+heart+failure:+Ensuring+regenerative+proficiency.">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy.">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li><li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration.">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li><li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracoronary+CD34++stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients:+5-year+follow-up.">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li><li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy:+the+POSEIDON+randomized+trial.">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li><li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+transplantation+of+mesenchymal+stromal+cells+for+chonic+myocardial+ischemia+and+impaired+left+ventricular+function:+Results+of+the+MESAMI+1+pilot+trial.">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function,+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction.">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li><li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease.">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+infusion+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction:+double-blind,+randomized+controlled+trial.">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162 (2015).</li><li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts.">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li><li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-kit(+)+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload.">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease:+role+of+exosomal+microRNA+transfer.">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li><li>Sahoo, S., Losordo, D. 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G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy.">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li><li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. 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H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1(+)+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration.">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265 (2011).</li><li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+cardiac+stem+cell+therapy:+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types.">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).</li><li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart:+Blind+Alley+or+Magic+Bullet?.">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li><li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+success+in+heart+failure:+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases.">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit++cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart.">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li><li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit++Cardiac+Progenitor+Cells.">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li><li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit++Sca-1++CXCR4++resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal,+postnatal,+and+adult+mouse+heart.">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li><li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy.">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li><li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles.">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li><li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs.">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li><li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenic+potential+of+C-kit(+)-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts.">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1+/CD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue.">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).</li><li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes:+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology.">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li></ol>

이 CSC 격리 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 1) 멸 균된 조건이 생쥐에서 심 혼의 추출에 대 한 유지 되어야 합니다. 심장 추출 하는 동안 어떤 오염 든 지 CSCs. 2의 품질을 손상 수 있습니다) 혈액 조각 HBSS 솔루션 전체 마음과 심장의 여러 가지 세척에 의해 이루어집니다 마음을 닦지 하기 전에 완전히 제거 해야 합니다. 3) 심장 조각은 콜라 솔루션으로 단일 셀 서 스 펜 션으로 완전히 ly...

허 혈 성 심장 질환, 심근 경색 (MI)를 포함 하 여 세계1주위 죽음의 주요 원인입니다. 죽은 심근 재생을 위한 줄기 세포 치료는 미 심장2,3,,45의 심장 기능을 개선 하는 주요 접근 남아 있다. 다른 종류의 줄기 세포 죽은 심근을 보충 하 고는 내 심장의 심장 기능을 개선 하기 위해 사용 되었습니다. 그들은 광범위 하 게 배아 줄기 세포6 및 성인 줄기 세포로 분류 될 수 있습니다. 성인 줄기 세포에서 다양 한 종류의 줄기 세포 사용 되었습니다, 단 세포 골 수에서 파생 된7,8, 골9,10, 지방 조직 에서에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 등 11,12및 탯13, CSCs14,15. 줄기 세포 심장 재생 paracrine 또는 내 분 비 작업16,17,18,,1920를 통해 홍보할 수 있습니다. 그러나, 줄기 세포 치료의 주요 한계 확산 수 있는 특정 심장 혈통21,22향해 분화 줄기 세포의 적절 한 번호를 얻는 이다. 헌 및 allogenic 이식 줄기 세포의 줄기 세포 치료9에 있는 중요 한 도전 이다. 그들은 마음에서 파생 하기 때문에 그들은 분화 될 수 있다 더 쉽게 심장 계보에 비 심장 줄기 세포 보다 CSCs 심장 재생을 위한 더 나은 방법은 수 있습니다. 따라서, 기형종의 위험을 줄여줍니다. 또한, 내 분 비 및 paracrine 효과 CSCs의 exosomes 등 miRNAs는 CSCs에서 파생 된 줄기 세포의 다른 유형 보다 더 효과적인 수 있습니다. 따라서, CSCs는 심장 재생23,24에 대 한 더 나은 옵션을 남아 있다.
CSCs는 그들의 심장 근원 때문에 미 마음에 심장 재생을 위한 더 나은 후보자, CSCs는 주요 한계는 효율적인 절연 방법의 부족으로 인해 더 적은 수확량. 또 다른 한계는 cardiomyocytes 리니지2,25,,2627향해 CSCs의 장애인된 차별 될 수 있습니다. 이러한 한계를 회피, CSC, 특성화, 고립과 심장 혈통으로 차별화에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발 하는 것 중요 하다. CSCs에 대 한 단일 허용 마커 없는 고는 특정 세포 표면 마커 기반 격리 CSCs의 적은 CSCs 수익률. 여기, 우리는 비용 효율적 이며 CSCs의 증가 수확량에서 결과 마우스 심장 CSCs 격리 하기 위해 간단한 그라데이션 원심 접근 표준화. 이러한 격리 CSCs 형광 활성화 셀 단락에 의해 특정 세포 표면 표식에 대 한 선택할 수 있습니다. CSCs 격리, 뿐만 아니라 우리는 CSC, 특성화, 문화와 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 프로토콜을 제공 했습니다. 따라서, 우리는 격리, 성격, 문화, CSCs 성인 마우스 마음 (그림 5)에서 분화 하는 우아한 방법 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson laboratory, USA</td>
			<td>Stock no. 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4-</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18976 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80892 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16667 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB4336 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8697 (goat polyclonal)</td>
			<td>NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84593 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEF2C</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-13268 (goat polyclonal)</td>
			<td>MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troponin I</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1691 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1682 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5490 (mouse polyclonal)</td>
			<td>ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 rabbit anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A11078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-488 checken anti-mouse</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex Fluor-594 checken anti-goat</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>Ref no. A21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSC maintenance medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM101</td>
			<td>Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cardiomyocytes differentiation medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Isolation buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2018-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>S1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal checken serum</td>
			<td>Vector laboratory</td>
			<td>S3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A100,0010</td>
			<td>Dapi, working concentration-1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>Cas No. 900-293-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Sceintific</td>
			<td>Lot No. 160170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell stainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syring</td>
			<td>BD</td>
			<td>Ref no. 309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrufuge machine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LEGEND X1R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS microscope</td>
			<td>Life technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippte aid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curve shank forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Fine Scientific Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells from the adult mouse heart

심근 경색 (MI)는 병 적 상태와 사망률 세계 각국의 주요 원인입니다. 재생 의학의 주요 목표는 미 후 죽은 심근을 보충. 여러 전략 심근을 다시 생성 하는 이용 되었다, 줄기 세포 치료는 내 심장의 죽은 심근을 보충 하는 주요 접근 남아 있다. 증거를 축적 성인 심장 및 심장 재생, paracrine 또는 내 분 비 효과에서 주민 심장 줄기 세포 (CSCs)의 존재를 제안 합니다. 그러나, CSC 절연 특성 및 심근 세포, 특히 cardiomyocytes 향해 차별화 기술 도전 남아 있습니다. 현재 연구에서 우리는 절연, 특성, 및 성인 마우스 마음에서 CSCs의 차별화에 대 한 간단한 방법을 제공. 여기, CSCs, 심장 0.2% 콜라 II 솔루션에 의해 소화 된다의 절연에 대 한 밀도 그라데이션 방법을 설명 합니다. 격리 CSCs 특성, 우리는 Sca 1, NKX2-5, 및 GATA4, CSCs/심장 마커 및 pluripotency/stemness 마커 OCT4, SOX2, 및 Nanog 식 평가. 우리는 또한 배양 접시에 배양 하 고 확산 표식 기-67의 식을 평가 하 여 절연된 CSCs의 확산 가능성을 결정. CSCs의 감 별 법 잠재력을 평가, 우리는 7-10 일 교양 CSCs 선택. 우리는 cardiomyocyte 차별화 매체와 새로운 접시에 그들을 전송. 그들은 셀 문화 인큐베이터에서 12 일 동안 incubated는 차별화 매체는 3 일 마다 변경 하는 동안. 차별화 된 CSCs 익스프레스 cardiomyocyte 특정 마커: actinin와 분 나. 따라서,이 프로토콜 절연 CSCs stemness 있고 심장 마커, 그리고 그들은 확산 및 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 가능성.

현재 연구에서 우리는 10 월에 12 주 된 C57BL/6J 남성 쥐 마음에서 CSCs 고립. 여기, 우리는 CSC 격리 및 pluripotency의 마커를 사용 하 여 특성을 위한 간단한 방법을 제시 했습니다. 우리는 또한 CSC 차별화 우아한 메서드와 CSCs cardiomyocytes 혈통으로 분화의 특성을 제시. 2-하 3-일-교양 CSCs (그림 1A 및 1B) 단계 대조 현미경의 스핀 들 모양 형태를 관?...

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Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

이 문서의 전반적인 목표는 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포, CSC의 격리, 특성화 및 분화에 대한 프로토콜을 표준화하는 것입니다. 이 방법은 심장 줄기 세포 치료 및 심부전과 같은 심혈관 질환 및 지역 치료 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 기간에 높은 원조와 비용 효과적이라는 것입니다.프로토콜에 설명된 바와 같이 멸균 된 상태에서 필요한 모든 재료, 계측기 및 격리 버퍼를 준비하여이 실험을 시작합니다. 안락사 마우스의 복부에서 피부를 제거 한 후, 흉부 구멍을 열 멸균 후드 내부의 흉곽을 잘라. 심장을 노출한 다음 1 밀리리터 주사기를 사용하여 심장 근처의 혈액을 제거합니다.심장 근처의 혈액을 제거하려면 얼음 차가운 PBS로 주변 지역을 씻으하십시오. 외과 가위와 핀셋을 사용하여 심장을 해부하고 10 밀리리터 얼음 차가운 PBS가 들어있는 100 mm 페트리 접시에 놓습니다. 구부러진 생크 집게를 사용하여 심장을 마비시키고 심장 내부의 잔류 혈액을 제거합니다.4~5개의 고립된 하트를 얼음 차가운 햄의 균형 잡힌 소금 용액 10밀리리터가 들어있는 100밀리리터 페트리 접시로 옮춥니까. 그들을 씻고 심장 안쪽에 잔류 혈액을 제거하기 위해 다시 마음을 망가. 혈액을 완전히 제거하려면 세척 할 때마다 HBSS 용액을 변경하십시오.각 심장에 집게를 들고 수술용 블레이드를 사용하여 각 심장을 100mm 페트리 접시에 5~7밀리리터를 함유한 페트리 접시에 2~4밀리미터 조각으로 자른다. 완전한 혈액 제거를 보장하기 위해 용액을 자주 변경합니다. 마지막으로 HBSS 솔루션에서 하트를 다진다.50밀리리터 원원형 튜브에 50밀리리터 원원형 튜브에 배치된 다진 하트를 500회 G, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한 다음 상퍼를 폐기합니다. 조직을 소화하기 위해 펠릿에 5~6밀리리터, 0.2%의 콜라게나아제 II 용액을 첨가합니다. 45~60분 동안 섭씨 37도에서 셰이커에 튜브를 75회 흔들어 펠릿을 철저히 정지시합니다.20-30분마다 손으로 튜브를 힘차게 흔들어 서다. 5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 lysed 조직 믹스를 트리투레이하고, 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 조직 덩어리를 해리시화합니다. 조직의 효소 용액을 중지하려면, lysed 조직의 부피만큼 시판되는 CSC 유지 보수 매체의 2 ~3 배를 추가하십시오.소화되지 않은 조직 조각을 제거하기 위해 50 밀리리터 원내 튜브에 놓인 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 소화된 세포 현탁액을 전달합니다. 세포를 구밀도 원심 분리로 분리하려면 섭씨 37도, 예열된 다각형 및 디아트리조아테 용액을 50밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다. 그런 다음 두 솔루션의 혼합을 피하면서 용액에 동일한 양의 여과를 부드럽게 천천히 추가합니다.45도에서 튜브를 기울여 튜브를 튜브 벽에 기울이면 혼합하지 않고 천천히 다각형 및 나트륨 디아트리조아테 용액위에 여과물을 추가하는 것이 중요합니다. 여과 위에 다각형 및 나트륨 디아트리조아테 용액을 첨가하지 마십시오. 튜브를 스윙 버킷 원심분리기에 매우 천천히 배치하여 솔루션을 방해하지 않도록 합니다.원심분리기는 2개의 용액을 혼합하지 않도록, 그리고 심장 줄기 세포의 적절한 분리를 위해 낮은 가속 및 감속 속도로 설정된 실온에서 20분 동안 500배 G에서. 원심분리기의 방해 없이 그라데이션 솔루션을 매우 신중하게 넣는 것이 중요합니다. 원심분리기의 가속과 감속은 하나 또는 0과 같은 가장 낮은 속도에 있어야 합니다.1mm 파이펫을 사용하여 CSC가 함유된 버피 코트를 상부 층에서 15밀리리터 멸균 튜브로 추가 용액으로 전송합니다. 동일한 양의 CSC 유지 보수 매체를 추가하고 제대로 혼합하여 잔류 다당류 및 나트륨 디아트리조아테 용액을 중화시합니다. 원심 분리기는 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 이 서스펜션을 사용한다.상부체를 폐기합니다. 불완전한 DMEM 솔루션으로 CSC의 세척을 적어도 두 번 반복하십시오. 원심분리기는 섭씨 4도에서 500회 G로 잔류 다각형 및 디아트리조아테 나트륨 용액을 제거합니다.상체를 제거한 후, 정제된 CSC를 함유한 펠릿을 1밀리리터 CSC 유지 보수 매체로 회수한 다음 세포를 계산합니다. CSC는 0.5%의 섬유네틴을 함유한 0.02%의 젤라틴 용액으로 코팅된 6웰 배양 판에 CSC를 시드하고 완전한 유지 보수 매체의 2밀리리터를 추가합니다. 5%의 CO2에서 섭씨 37도에서 세포를 성장시면 됩니다.CSC 배양이 합류에 도달하면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포를 새로운 젤라틴 및 섬유넥틴 코팅 플레이트로 이송합니다. 문화권은 P0 CSC를 컨실루까지 5%의 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도의 완전한 CSC 유지 보수 매체로 전송했습니다. 추가 실험에 사용할 수 있는 P1 CSC를 만들기 위해 새 플레이트로 셀 전송을 반복합니다.초기 단계에서 CSC 배양을 유지하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 셀을 더 시드합니다. 배양 된 세포를 특성화하기 위해, 형광 현미경의 목표에 플레이트를 포함하는 CSC를 배치합니다. 10배 배율을 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다.세포를 관찰하려면 위상 대비 조리개를 사용하고 객관적인 렌즈를 변경하여 배율을 20배로 늘린 다음 CS를 이미지화합니다. 면역 염색을 수행 한 후, 형광 현미경 아래에 배양 판을 놓습니다. 다른 배율에 세포를 집중하고, 위상 대비 및 상이 다른 여기 필터하에서 세포를 관찰하고, 이미지를 저장합니다.세포 분화를 위해, 섭씨 37도, 미리 따뜻해지는 CSC 유지 보수 매체의 2밀리리터로 6웰 플레이트에서 CSC를 성장시다. 세포가 80 ~95%의 합류에 도달하면 유지 보수 매체를 섭씨 37도, 미리 따뜻워진 심근세포 분화 매체로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 최대 2~3주 동안 5%의 CO2로 배양합니다.2~3일마다 분화 매체를 변경합니다. 중간 변화 동안, 좋은 배양 조건을 보장하기 위해 현미경으로 세포 형태를 관찰한다. 12일 후, 표준 면역염색 프로토콜에 따라 분화 마커에 대한 세포를 이미지화한다.2~3일 배양된 CSC는 위상 대비 현미경하에서 관찰될 때 스핀들 모양의 형태를 보여줍니다. 문화의 7 일 후, 그들은 길어지고 형태에 변화를 보여줍니다. 자발성 마커에 대한 면역 염색 후, CSC는 OCT4, SOX2 및 나노그의 발현을 보여줍니다.또한, CSC는 배양 배지에서 확산되고, 증식 마커 Ki67을 표현한다. CSC의 심장 기원을 특성화하기 위해 심장 마커의 발현을 검사하고 세포는 심장 마커 Sca-1, NKX2.5 및 GATA4에 대해 양성인 것으로 나타났다. 12일 동안 심근세포 분화 배지에서 배양한 후, 차별화된 CSCs는 ACTIN, 및 TROPONIN-I의 심근세포 마커의 발현을 보여준다.이 절차를 시도하는 동안 그라데이션 솔루션과 여과율을 혼합하지 않는 것이 중요합니다. 가속과 감속을 최저 속도로 설정하는 것도 중요합니다. 누구든지 오염하는 사람은 생물 안전 캐비닛 내부의 모든 세포 격리 공정을 수행하는 것이 좋습니다.이 절차에 따라, 자기 비드 기반 분리 또는 유동 세포 세포 선별 방법과 같은 다른 방법은 심장 줄기 세포의 균일 한 인구와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다? 심장 줄기 세포의 균열 반경은 큰 마커이며 심근 세포에 대한 차이가 있습니다. 개발 후, 이 기술은 종종 허혈성 심부전의 재생 치료에 중요 할 수있는 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 높은 수율을 심혈관 질환의 분야에서 연구원을위한 길을 열 것입니다.수술용 블레이드, 표백제 및 DMSO와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 인력 보호 장비인 PPE를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...