Name: in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00
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Nous sommes reconnaissants au noyau d’imagerie préclinique à l’école de médecine de l’Université de New York, avec remerciements à Orlando Aristizabal et Youssef Zaim Wadghiri. Le noyau est une ressource partagée, partiellement pris en charge par la 5P30CA016087 Laura et Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI et ingénierie biomédicale Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Ce travail a été soutenu par l’American Diabetes Association « Voie à arrêter le diabète » à D.C. [numéro de licence 1-16-ACE-08] et le NYU appliqué recherche Fonds d’appui à P.R.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de New York University School of Medicine. Toutes les souris sont logés derrière une barrière et tout le personnel de porte un équipement de protection individuelle approprié.
1. jour 0 : La préparation d’un modèle murin de cicatrisation excisionnelle
<ol><li>Anesthésier les souris diabétiques de (Leprdb/db), âgés de 8 à 12 semaines, à l’inhalation isof...

<ol>
	<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NAD(P)H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012.">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li><li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012.">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li><li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012.">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation.">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li><li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li><li>Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing.">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li><li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche.">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals.">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li><li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li><li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+L-012,+a+luminol-based+chemiluminescent+probe,+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase:+a+reevaluation.">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds.">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing.">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li></ol>

Les techniques courantes de mesure de ROS ont été limités par des protocoles complexes nécessitant une extraction de tissu ou de la même façon des techniques invasives. Ces dernières années, les mesures du stress oxydatif ont été signalés sur la base de modalités d’imagerie innovantes, permettant ainsi à des évaluations spatio-temporelles9,10,11. L-012 présente plusieurs avantages comme une sonde chimioluminesce...

Métabolites d’oxygène générés par le biais de processus inflammatoires contribuent à différentes cascades de signalisation ainsi qu’altération destructive des composants cellulaires1. Utilisant des techniques sensibles et spécifiques pour mesurer le ROS est essentiel pour l’étude des processus inflammatoires et de caractériser les effets du stress oxydatif. L’imagerie in vivo est précieux en raison de sa capacité à fournir des données dynamiques spatiales et temporelles dans les tissus vivants. L-012 est une sonde chimioluminescente synthétique qui est hautement sensible pour les anions superoxydes et produit une intensité lumineuse plus élevée que les autres sondes fluorescentes dans les cellules, de tissus et de sang total1,2,3, 4. il a été avec succès employé pour l’imagerie in vivo dans des modèles murins pour étudier plusieurs maladies inflammatoires, y compris l’arthrite et la colite5,6. Il n’a pas encore devant être utilisés dans une modèle de cicatrisation cutanée établie. Mesure de ROS généré est également pertinent évaluer la progression de la cicatrisation des plaies dans des conditions différentes. La sensibilité et le caractère non invasif de cette méthode en fait une technique prometteuse pour étudier la cicatrisation dans les modèles murins.
Nrf2 est un facteur déterminant de la réponse de l’antioxydant et un facteur de transcription avec une spécificité pour l’élément de réponse antioxydante (ARE) commun pour les régions promotrices de plusieurs d’enzymes antioxydantes8. En l’absence de stress oxydatif, Nrf2 est séquestré dans le cytoplasme par Keap1, ce qui provoque par la suite son ubiquitination et la dégradation. Déséquilibre de la voie Nrf2/Keap1 a été impliquée dans l’homéostasie redox inapproprié et cicatrisation retardée dans le cadre d’une augmentation du stress oxydatif,9. Nous avons déjà montré que la suppression de Keap1 stimule l’augmentation de l’activité Nrf2 et favorise des plaies de sauvetage de la guérison des plaies cutanées pathologiques chez les diabétiques9.
Nous décrivons ici un protocole qui utilise L-012 a contribué bioluminescence d’imagerie pour mesurer les concentrations ROS dans un modèle de guérison excisionnelle plaie cutanée, ce qui est essentiel pour mettre en évidence l’association entre les BR et la cicatrisation des plaies. Cette technique montre des changements en temps réel fardeau oxydant dans les plaies et de la périphérie immédiate. En outre, cette méthode permet pour une évaluation rapide des interventions et des mécanismes de cette manipulation de redox affect. Ici, nous utilisons un modèle de knockdown Keap1 pour la restauration de l’homéostasie redox pour évaluer l’applicabilité de notre stratégie. Parce que notre technique est non invasive et blessures sont intacts, le même animal peut être utilisé pour approfondir les analyses confirmatoires sur la base de lysats histologie ou de la cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:265px;">BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice</td>
			<td style="width:164px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">000642</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>665581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3M Tegaderm Transparent Film Dressings</td>
			<td>3M</td>
			<td>88-1626W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keap1 Stealth siRNA</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>1299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silencer negative control&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM4635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9004-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-012</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>120-04891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model

La génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une caractéristique des processus inflammatoires, mais en excès, stress oxydatif est largement impliqué dans diverses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et le diabète. Nous avons déjà montré que la dysfonction du facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes)-comme 2 (Nrf2) / érythroïdes Kelch-comme culture cellulaire protéines 1 (Keap1) signalisation voie conduit à extrême déséquilibre ROS lors cutanée la cicatrisation chez les diabétiques. Étant donné que les niveaux ROS sont un indicateur important de la progression de la cicatrisation des plaies, des techniques de quantification précises et exactes sont précieux. Plusieurs essais in vitro pour mesurer des ROS dans les cellules et les tissus ont été décrites ; Toutefois, ils fournissent uniquement une seule mesure cumulative par échantillon. Plus récemment, ont permis le développement d’indicateurs de base de protéines et de modalités d’imagerie unique analyse spatio-temporelle. L-012 (C13H8ClN4NaO2) est un dérivé de luminol qui peut servir à la fois in vivo et in vitro par chimiluminescence détection de ROS générées par l’oxydase de NADPH. L-012 émet un signal plus fort que les autres sondes fluorescentes et s’est avéré être sensible et fiable pour la détection de ROS. L’applicabilité de laps de temps de L-012-facilité d’imagerie fournit des renseignements précieux sur les processus inflammatoires tout en réduisant la nécessité pour le sacrifice et dans l’ensemble le nombre d’animaux de l’étude. Nous décrivons ici un protocole utilisant L-012-facilité in vivo d’imagerie afin de quantifier le stress oxydatif dans un modèle de cicatrisation excisionnelle utilisant des souris diabétiques avec localement dysfonctionnel Nrf2/Keap1.

Trois jours après la création des plaies bilatéraux selon un modèle établi plaie excisionnelle (Figure 1 a), les souris diabétiques sont placés dans la salle d’imagerie. Une photographie initiale et une mesure de bioluminescence sont prises avant l’injection de L-012 pour tenir compte des signaux de fond (Figure 1 b). Suite à une injection intrapéritonéale avec la solution de L-012, les souris sont repositionnés da...

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In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Nous décrivons une non invasif en vivo imagerie protocole c’est facile et économique, utilisant L-012, un analogue de luminol chimiluminescence, de visualiser et de quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générés dans un modèle murin excisionnelle enroulé.

In Vivo Imagerie des espèces réactives de l’oxygène dans un murin plaie modèle

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la réparation et de la régénération des tissus au sujet des associations entre les voies cytoprotectrices, le stress oxydatif et la réponse à la cicatrisation des plaies. Le principal avantage de cette technique puissante est que vous pouvez mesurer les espèces réactives d’oxygène dans une plaie, en temps réel, pour déterminer leur impact sur la régénération des tissus. Jennifer Kwong, assistante de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.Utilisez un glucomètre pour mesurer la glycémie de chaque souris diabétique anesthésiée de huit à 12 semaines. Et utilisez un coupe-cheveux et une crème depilatory pour enlever les cheveux dorsales du premier animal. Utilisez des lingettes d’alcool deux fois pour nettoyer la peau exposée et draper l’animal de sorte que seule la zone chirurgicale est exposée.Lorsque l’alcool a séché, utilisez des poinçons stériles de biopsie de 10 millimètres pour créer deux plaies de 10 millimètres d’épaisseur qui s’étendent à travers le carnosus panniculus selon une technique excisionnelle bien établie de cicatrisation des plaies. Utilisez une feuille de silicone de 0,5 millimètre d’épaisseur avec des découpes circulaires de 10 millimètres pour attiser les plaies ouvertes et fixer les relais avec des sutures de soie interrompues 4/0. Placez ensuite les souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète, avant de retourner à sa cage individuelle, en fournissant des serviettes en papier comme matériau de nidification supplémentaire pendant deux semaines.Le lendemain, appliquez soit un petit gel d’ARN interférant de contrôle, soit un petit gel keap1 expérimental interférant sur le dessus de la plaie de chaque animal et enveloppez chaque torse d’un pansement transparent pour maintenir le gel en place tout en laissant les membres libres. Au troisième jour de l’expérience, chargez une seringue d’un millimètre munie d’une aiguille de calibre 27 avec une solution L-012 fraîchement préparée et enveloppez la seringue pour protéger la solution de la lumière. Pour filmer les plaies, retirez doucement le pansement transparent de chacune des souris sans déranger les plaies et placez les souris dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie par bioluminescence.Réglez l’afflux du système d’imagerie et les niveaux d’oxygène de la chambre d’induction à un litre par minute et imagez les souris par bioluminescence et champ lumineux à la ligne de base. Ensuite, essuyez les abdomens avec des lingettes d’alcool, puis injectez cinq milligrammes de solution L-012 par poids corporel de 200 grammes, IP, dans chaque souris une fois que l’alcool a séché. L’injection de la solution L-012 sans déranger les plaies sur la peau dorsale est essentielle, car toute distorsion affectera la trajectoire de cicatrisation des plaies et l’interprétation des données.Assurez-vous que l’animal est solidement en récumbence dorsale avant l’injection. Immédiatement après l’injection, remettre les souris dans leurs emplacements respectifs dans la chambre d’imagerie et l’image des animaux pendant une minute toutes les quatre minutes sur une période d’imagerie de 60 minutes, définissant la plaie de 10 millimètres comme la région d’intérêt pour déterminer le niveau d’espèces réactives d’oxygène. Placez ensuite les souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elles se rétablissaient complètement avant de retourner les animaux dans leurs cages individuelles.Trois jours après avoir créé des blessures bilatérales selon le modèle excisional établi de blessure, aucune bioluminescence n’est observée avant l’injection de L-012. Après l’injection intraperintoneal de solution L-012, la bioluminescence est observée dans les secteurs de la blessure où des espèces réactives d’oxygène sont détectées. L’enregistrement de la bioluminescence pendant une minute toutes les quatre à cinq minutes sur une période de 60 minutes démontre la saturation bioluminescente de la région d’intérêt au fil du temps, avec le temps d’imagerie optimal pour atteindre la saturation complète de L-012 observée à environ 50 minutes.La bioluminescence dans chaque région d’intérêt de blessure avant et après injection de L-012 dans le petit ARN interférant non-sens traité ou keap1 petites souris traitées par ARN interférant peut alors être calculée en divisant les comptes totaux de l’intensité lumineuse par la région. L’analyse des sections de tissu de blessure de jour 10 pour confirmer l’exactitude de la mesure réactive de niveau d’espèce d’oxygène par la coloration de H&E indique une infiltration cellulaire réduite dans de petites blessures traitées par Keap1 interférant par rapport aux petits tissus traités non-sens interférants, indiquant une morphologie inflammatoire réduite chez les animaux gel-traités expérimentaux. L’analyse de l’immunoréactivité de F4/80, un marqueur macrophage de protéine sur des sections de tissu de blessure, indique un nombre réduit de macrophages dans de petites blessures traitées par Keap1 interférant par rapport aux petites blessures non-traitées interférantes, soulignant davantage la validité de cette méthode.Lorsque vous essayez cette procédure, assurez-vous de confirmer que le L-012 n’est pas expiré et de remuer la solution dans un endroit protégé de la lumière. À la suite de cette procédure, des sondes ciblées et des méthodes basées sur l’immuno-analyse peuvent être utilisées pour étudier la localisation subcellulaire des espèces réactives d’oxygène et leurs corrélats, permettant une évaluation rapide des interventions et des mécanismes qui affectent les statistiques redux des plaies.

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