Name: in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00
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Siamo grati al nucleo Imaging preclinico presso la NYU School of Medicine, con un ringraziamento speciale Aristizabal Orlando e Youssef Zaim Wadghiri. Il nucleo è una risorsa condivisa parzialmente supportata da Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB Biomedical Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del diabete "Pathway per fermare il diabete" D.C. [concessione numero 1-16-ACE-08] e al NYU applicato ricerca supporto fondo di P.R.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della New York University School of Medicine. Tutti i topi sono alloggiati dietro una barriera e tutto il personale indossano adeguati dispositivi di protezione personale.
1. giorno 0: Preparazione del modello murino di Excisional cicatrizzazione
<ol><li>Anestetizzare topi diabetici (Leprdb/db), età compresa tra 8 – 12 settimane, con inhalational 2% isoflurane. Confermare che ogni mou...

<ol>
	<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NAD(P)H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012.">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li><li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012.">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li><li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012.">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation.">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li><li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li><li>Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing.">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li><li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche.">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals.">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li><li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li><li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+L-012,+a+luminol-based+chemiluminescent+probe,+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase:+a+reevaluation.">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds.">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing.">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li></ol>

Tecniche comuni per la misurazione di ROS sono state limitate tramite protocolli complessi che richiedono l'estrazione di tessuto o allo stesso modo le tecniche invasive. Negli ultimi anni, le misure dello sforzo ossidativo sono state segnalate sulla base di modalità di imaging innovative, consentendo in tal modo per valutazioni spatiotemporal9,10,11. L-012 ha diversi vantaggi come una sonda chemiluminescente rispetto al lumino...

I metaboliti dell'ossigeno generati attraverso processi infiammatori contribuiscono a diverse cascate di segnalazione così come alterazione distruttiva delle componenti cellulari1. Utilizzando tecniche sensibili e specifiche per misurare il ROS è fondamentale per lo studio dei processi infiammatori e caratterizzare gli effetti dello stress ossidativo. In vivo imaging è prezioso a causa della sua capacità di fornire dati dinamici spaziali e temporali nel tessuto vivente. L-012 è una sonda chemiluminescente sintetica che è altamente sensibile per gli anioni superossido e produce un'intensità luminosa rispetto altre sonde fluorescenti in cellule, tessuti e sangue intero1,2,3, 4. è stato impiegato con successo per l'imaging in vivo in modelli murini per lo studio di parecchie malattie infiammatorie, tra cui l'artrite e colite5,6. Deve ancora essere impiegato in un modello di cicatrizzazione cutanea stabilita. Misura del ROS generati sono altrettanto rilevante per valutare la progressione della guarigione della ferita in condizioni diverse. La sensibilità e la natura non invadente di questo metodo rende una tecnica promettente per lo studio della guarigione delle ferite attraverso modelli murini.
Nrf2 è delle principali cause della risposta antiossidante e un fattore trascrizionale con specificità per l'elemento di risposta antiossidante (ARE) comune per le regioni promotrici di diversi antiossidanti enzimi8. In assenza di stress ossidativo, Nrf2 è sequestrato nel citoplasma di Keap1, che successivamente causa sua ubiquitinazione e degradazione. Squilibrio del pathway Nrf2/Keap1 è stato implicato nella omeostasi redox inappropriati e ritardata guarigione delle ferite nella regolazione di sforzo ossidativo aumentato9. Precedentemente abbiamo indicato che la soppressione di Keap1 stimola l'attività aumentata di Nrf2 e promuove il salvataggio di guarigione arrotolata cutanea patologica nei diabetici ferite9.
Qui descriviamo un protocollo che utilizza L-012-assistita bioluminescenza imaging per misurare i livelli di ROS in un modello di guarigione della ferita cutanea escissionale, che è fondamentale per evidenziare l'associazione tra ROS e la guarigione della ferita. Questa tecnica viene illustrato le modifiche in tempo reale in carico ossidativo all'interno di ferite e immediata periferia. Inoltre, questo metodo consente rapida valutazione degli interventi e meccanismi che influenzano la gestione delle redox. Qui usiamo un modello di atterramento Keap1 per il ripristino dell'omeostasi redox per valutare l'applicabilità della nostra strategia. Perché la nostra tecnica è non invasiva e ferite sono indisturbate, lo stesso animale può essere utilizzato per ulteriori analisi di conferma sulla base di istologia o cella lisati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:265px;">BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice</td>
			<td style="width:164px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">000642</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>665581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3M Tegaderm Transparent Film Dressings</td>
			<td>3M</td>
			<td>88-1626W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keap1 Stealth siRNA</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>1299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silencer negative control&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM4635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9004-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-012</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>120-04891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model

La generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è una caratteristica dei processi infiammatori, ma in eccesso, lo sforzo ossidativo è ampiamente implicato in varie patologie come il cancro, aterosclerosi e diabete. Precedentemente abbiamo indicato che la disfunzione del fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2)-come 2 (Nrf2) / degli eritrociti Kelch-come cellula-derivato proteina 1 (Keap1) segnalazione sentiero conduce ad estremo squilibrio ROS durante cutanea delle ferite in diabete. Poiché i livelli di ROS sono un importante indicatore di progressione della guarigione delle ferite, tecniche specifiche e accurata quantificazione sono preziosi. Sono stati descritti diversi saggi in vitro per misurare il ROS in cellule e tessuti; Tuttavia, essi forniscono solo una singola misurazione cumulativa per campione. Più recentemente, hanno consentito lo sviluppo di indicatori basati su proteine e modalità di imaging uniche analisi spazio-temporale. L-012 (C13H8ClN4NaO2) è un derivato di luminol che può essere utilizzato per sia in vivo che in vitro chemiluminescente rilevamento di ROS generati dall'ossidasi di NAPDH. L-012 emette un segnale più forte rispetto altre sonde fluorescenti e ha dimostrato di essere sensibile e affidabile per la rilevazione di ROS. L'applicabilità del lasso di tempo del L-012-facilitato imaging fornisce informazioni preziose sui processi infiammatori, riducendo la necessità del sacrificio e nel complesso riducendo il numero di animali di studio. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza L-012-facilitato in vivo imaging per quantificare lo sforzo ossidativo in un modello di excisional cicatrizzazione utilizzando topi diabetici con localmente disfunzionale Nrf2/Keap1.

Tre giorni dopo la creazione di ferite bilaterale secondo un modello stabilito ferita excisional (Figura 1A), topi diabetici sono posizionati nella camera di imaging. Una fotografia iniziale e una misura della bioluminescenza sono tenuti prima dell'iniezione di L-012 al segnale di fondo (Figura 1B). A seguito di iniezione intraperitoneale con la soluzione di L-012, i topi vengono riposizionati nella camera e bioluminescenza è vi...

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In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Descriviamo un non-invasiva in vivo imaging protocol che è semplice e conveniente, utilizzando L-012, un a chemiluminescenza luminol-analogico, per visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate in un modello murino di excisional ferita.

In Vivo Formazione immagine di specie reattive dell'ossigeno in un murino ferita modello

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione e rigenerazione dei tessuti sulle associazioni tra le vie citoprotettive, lo stress ossidativo e la risposta di guarigione delle ferite. Il vantaggio principale di questa potente tecnica è che è possibile misurare le specie reattive dell'ossigeno in una ferita, in tempo reale, per determinare il loro impatto sulla rigenerazione dei tessuti. A dimostrare la procedura con me sarà Jennifer Kwong, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio.Utilizzare un glucometro per misurare la glicemia di ogni topo diabetico anestetizzato di otto-12 settimane. E usa un trimmer per capelli e una crema depilatoria per rimuovere i capelli dorsali dal primo animale. Utilizzare salviette alcoliche due volte per pulire la pelle esposta e drappeggiare l'animale in modo che sia esposta solo l'area chirurgica.Quando l'alcol si è asciugato, utilizzare punzoni sterili da 10 millimetri di biopsia per creare due ferite a pieno spessore di 10 millimetri che si estendono attraverso il panniculus carnosus secondo una ben consolidata tecnica di guarigione della ferita adcisionale. Utilizzare un foglio di silicone spesso 0,5 millimetri con ritagli circolari da 10 millimetri per steccare le ferite e fissare i stint con suture di seta interrotte 4/0. Quindi posizionare i topi su un dissipatore di calore con monitoraggio fino al pieno recupero, prima di tornare alla sua gabbia individuale, fornendo asciugamani di carta come materiale di nidificazione aggiuntivo per due settimane.Il giorno dopo, applicare o controllare sciocchezze piccolo gel di RNA interferente o piccolo gel Keap1 interferente sperimentale sulla parte superiore della ferita di ogni animale e avvolgere ogni busto con una medicazione trasparente del film per mantenere il gel in posizione lasciando gli arti liberi. Il terzo giorno dell'esperimento, caricare una siringa da un millimetro dotata di un ago calibro 27 con soluzione L-012 preparata al momento e avvolgere la siringa per proteggere la soluzione dalla luce. Per immaginare le ferite, rimuovere delicatamente la medicazione trasparente del film da ciascuno dei topi senza disturbare le ferite e posizionare i topi nella camera di imaging di un sistema di imaging a bioluminescenza.Impostare l'afflusso del sistema di imaging e i livelli di ossigeno della camera di induzione su un litro al minuto e immaginare i topi per bioluminescenza e campo luminoso al basale. Successivamente, pulire gli addome con salviette alcoliche, quindi iniettare cinque milligrammi di soluzione L-012 per 200 grammi di peso corporeo, IP, in ogni topo una volta che l'alcol si è asciugato. Iniettare la soluzione L-012 senza disturbare le ferite sulla pelle dorsale è fondamentale, perché qualsiasi distorsione influenzerà la traiettoria di guarigione della ferita e l'interpretazione dei dati.Assicurarsi che l'animale sia saldamente in recumbency dorsale prima dell'iniezione. Immediatamente dopo l'iniezione, riposizionare i topi nelle rispettive posizioni nella camera di imaging e immaginare gli animali per un minuto ogni quattro minuti in un periodo di imaging di 60 minuti, definendo la ferita di 10 millimetri come la regione di interesse per determinare il livello di specie reattive dell'ossigeno. Quindi posizionare i topi su una pastiglia termica con monitoraggio fino al pieno recupero prima di riportare gli animali nelle loro gabbie individuali.Tre giorni dopo aver creato ferite bilaterali secondo il modello di ferita adcisionale stabilito, non si osserva bioluminescenza prima dell'iniezione di L-012. A seguito dell'iniezione intraperintoneale della soluzione L-012, la bioluminescenza si osserva nelle aree della ferita in cui vengono rilevate specie reattive dell'ossigeno. La registrazione della bioluminescenza per un minuto ogni quattro o cinque minuti nel corso di 60 minuti dimostra la saturazione bioluminescente della regione di interesse nel tempo, con il tempo di imaging ottimale per raggiungere la saturazione completa di L-012 osservata a circa 50 minuti.La bioluminescenza in ogni regione di interesse della ferita prima e dopo l'iniezione di L-012 in piccoli RNA interferenti senza senso trattati o topi trattati con RNA interferente Keap1 può quindi essere calcolata dividendo il conteggio totale dell'intensità della luce per l'area. L'analisi delle sezioni del tessuto delle ferite del giorno 10 per confermare l'accuratezza della misurazione reattiva del livello delle specie di ossigeno mediante colorazione H&E rivela una ridotta infiltrazione cellulare in piccole ferite trattate keap1 interferenti rispetto a piccoli tessuti trattati senza senso interferenti, indicando una ridotta morfologia infiammatoria negli animali sperimentali trattati con gel. L'analisi dell'immuno-reattività di F4/80, un marcatore di macrofagi proteici sulle sezioni del tessuto della ferita, indica un numero ridotto di macrofagi in piccole ferite trattate keap1 interferenti rispetto a piccole ferite trattate senza senso interferenti, sottosogliendo ulteriormente la validità di questo metodo.Quando si tenta questa procedura, assicurarsi di confermare che l'L-012 non è scaduto e di mescolare la soluzione in un luogo protetto dalla luce. Seguendo questa procedura, sonde mirate e metodi basati su immuno-test possono essere utilizzati per studiare la localizzazione subcellulare delle specie reattive dell'ossigeno e dei loro correlati, consentendo una rapida valutazione degli interventi e dei meccanismi che influenzano le statistiche redux delle ferite.

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