Name: in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00
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医学 NYU オーランド アリスティバルとユーセフ Zaim Wadghiri のおかげで特別な前臨床イメージング コアに感謝しております。コアは、ローラとアイザック パールミュッターがんセンター サポート助成金 NIH/NCI 5P30CA016087 と NIBIB バイオメディカル技術リソース センター助成金 NIH P41 EB017183、部分的にサポート、共有リソースです。この作業は [許可番号 1-16-エース-08] d. c. と p. r. に NYU 適用研究支援基金に米国糖尿病協会「糖尿病を停止する経路」によって支えられた

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会のニューヨーク大学医学部によって承認されています。すべてのマウス、障壁の後ろに収容され、すべての要員は適切な個人用保護具を着用します。
1 日 0: 切除創傷治癒のマウスモデルの作製
<ol><li>2% イソフルレンの吸入で、8-12 週間を高齢者、糖尿病 (Leprdb/db) マウスを麻酔します。確認、適?...

<ol>
	<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NAD(P)H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012.">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li><li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012.">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li><li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012.">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation.">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li><li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li><li>Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing.">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li><li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche.">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals.">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li><li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li><li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+L-012,+a+luminol-based+chemiluminescent+probe,+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase:+a+reevaluation.">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds.">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing.">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li></ol>

ROS を測定するための一般的な手法は、組織抽出または同様に侵襲的な技術を必要とする複雑なプロトコルによって制限されています。近年、酸化ストレスの測定は、革新的な画像診断装置をそれによって時空間評価9,10,11に基づいて報告されています。L-012 は、ルミノール、ルシゲニン、MCLA1,<sup ...

炎症性プロセスによって生成された酸素代謝は細胞成分1の破壊的な変更と同様、様々 なシグナル伝達カスケードに貢献します。ROS を測定する高感度および特定の技術は、炎症性プロセスを調査し、酸化ストレスの影響を特徴付けるのため重要です。In vivoイメージングは、生体組織の動的空間的および時間的なデータを提供する能力のため貴重です。L-012 はスーパーオキシド陰イオンの高感度は、細胞、組織、および全血1,2,3,その他蛍光プローブより高い光強度を生成する合成化学発光プローブ4. 関節炎、大腸炎の5,6を含むいくつかの炎症性疾患を研究する生体内イメージング マウスモデルでの正常に採用されています。まだ確立された皮膚創傷治癒モデルで採用される必要があります。生成される活性酸素の測定はさまざまな条件下での創傷治癒の進行を評価するために均等に関連です。感度とこのメソッドの非侵襲的自然治癒マウス モデル間でを研究のための有望な技術になります。
Nrf2 は抗酸化反応といくつか抗酸化酵素8のプロモーター領域に一般的な抗酸化剤応答要素 (は) に特異的な転写因子の主要なドライバーです。酸化ストレスのない場合は、Nrf2 は Keap1 は、その後そのユビキチン化と分解を原因によって細胞質内に隔離されます。Nrf2/Keap1 経路の不均衡は、不適切なレドックスの恒常性と酸化ストレスの増加9の設定の遅延の創傷治癒過程に関与しています。我々 は以前、Keap1 の抑制が Nrf2 活性の上昇を刺激し、促進することを示されている糖尿病の病理学的皮膚創傷治癒過程の救助傷9。
ここで ROS や創傷治癒の間の関連付けを強調するため非常に重要です切除皮膚創傷治癒モデルにおける ROS レベルを測定するイメージング L 012 補助発光を利用するプロトコルについて述べる。この手法は、傷および即時の周囲の内で酸化的負担にリアルタイムの変更を示します。さらに、このメソッドは、介入およびメカニズムの迅速な評価のため、影響を与える酸化還元処理をするをできます。ここで酸化還元の恒常性の回復のための戦略の有効性を評価するのにKeap1 ノックダウンのモデルを使用します。本手法は非侵襲的傷が妨げられるため、同じ動物は組織またはセル lysates に基づいてさらに確証的解析に使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:265px;">BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice</td>
			<td style="width:164px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">000642</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>665581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3M Tegaderm Transparent Film Dressings</td>
			<td>3M</td>
			<td>88-1626W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keap1 Stealth siRNA</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>1299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silencer negative control&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM4635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9004-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-012</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>120-04891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model

活性酸素種 (ROS) の生成は炎症性プロセスの特徴が、過剰な酸化ストレスは広くがん、動脈硬化、糖尿病など様々 な疾患に関与。我々 は以前に核因子 (赤血球由来 2) の機能障害-2 (Nrf2) のような糖尿病患者の創傷処置生理: Kelch 様赤芽球細胞由来蛋白質 1 (Keap1) を信号経路は、皮膚の中にロスが極端に不均衡につながる/。ROS レベルは創傷治癒の進行の重要な指標であるので、具体的かつ正確な定量化技術、貴重です。細胞や組織の活性酸素を測定するいくつか生体外の試金が記載されています。しかし、彼らはのみサンプルあたり 1 つの累積的な測定を提供します。最近では、タンパク質ベースのインジケーターおよびイメージ投射様相の開発独自の時空間解析許可されています。L-012 (C13H8ClN4直2)、ルミノール誘導体の生体内と体外の化学発光の両方に使用できるNAPDH 酸化酵素によって生成される活性酸素の検出。L-012 他蛍光プローブより強い信号を出力し、機密とロスを検出するため信頼性の高いことが示されています。L 012 促進イメージングの時間経過の適用性は、犠牲の必要性を削減し、全体的な研究の動物の数を減らす炎症性プロセスに関する貴重な情報を提供します。ここでは、L 012 促進体内糖尿病マウスを用いたローカル機能不全 Nrf2/Keap1 の切除創傷治癒モデルにおける酸化ストレスを定量化するイメージングを利用したプロトコルについて述べる。

確立された切除傷モデル (図 1 a) によると二国間の傷を作成した後 3 日間糖尿病マウスは、イメージングの商工会議所に配置されます。初期の写真と発光のメジャーがバック グラウンド信号 (図 1 b) を考慮して L-012 の注入前にされます。L-012 ソリューションと腹腔内投与は、マウスが商工会議所の再配置し、ROS が検出され...

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In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.

生体内でマウスにおける活性酸素種のイメージング創モデル

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

この方法は、細胞保護経路、酸化ストレス、および創傷治癒応答の間の関連に関する組織修復および再生分野の重要な質問に答える助けとなる。この強力な技術の主な利点は、傷口の活性酸素種をリアルタイムで測定して、組織再生への影響を判断できることです。私と一緒に手順を実証することは、私の研究室の研究アシスタントであるジェニファー・クォンです。グルコメーターを使用して、8〜12週齢の糖尿病マウスの各麻酔薬の血糖値を測定します。そして、最初の動物から後毛を除去するためにヘアトリマーと脱毛クリームを使用してください。アルコール拭き取り2回を使用して、露出した皮膚をきれいにし、手術領域だけが露出するように動物をドレープします。アルコールが乾燥したら、滅菌10ミリメートル生検パンチを使用して、十分に確立された切除傷治癒技術に従ってパンニクルカルノーサスを通って延びる2、10ミリメートルの完全な厚さの創傷を作成する。厚さ0.5ミリメートルのシリコーンシートを使用し、10ミリメートルの円形の切り抜きを使用して傷口を開き、4/0シルク縫合糸を中断してスティントを固定します。その後、マウスを完全に回復するまでモニタリングしてヒートパッドに置き、個々のケージに戻り、ペーパータオルを2週間追加のネスティング材料として提供します。翌日、各動物の創傷の上部にナンセンス小さな干渉RNAゲルまたは実験的な小さな干渉Keap1ゲルを制御し、各胴体を透明なフィルムドレッシングで包み、手足を自由にしたままゲルを所定の位置に保ちます。実験の3日目に、27ゲージの針を取り付けた1ミリメートルの注射器に作りたてのL-012溶液を積み込み、注射器を包んで溶液を光から守ります。創傷を画像化するには、各マウスから透明フィルムドレッシングを傷を邪魔することなく穏やかに除去し、マウスを生物発光イメージングシステムのイメージングチャンバーに入れます。撮像システムの流入と誘導室の酸素レベルを毎分1リットルに設定し、ベースラインで生物発光と明るいフィールドでマウスを画像化します。次に、アルコール拭きで腹部を拭き、アルコールが乾燥したら、体重200グラムあたり5ミリグラムのL-012溶液(IP)を各マウスに注入します。任意の歪みが創傷の治癒軌道とデータ解釈に影響を与えるので、後ろ肌の傷を乱すことなくL-012溶液を注入することは重要です。注射前に動物が安全に下振れ状態にあることを確認してください。注射の直後に、マウスをイメージングチャンバーのそれぞれの位置に戻し、60分間のイメージング期間にわたって4分間1分間動物を画像化し、10ミリメートルの創傷を活性酸素種のレベルを決定するための関心領域として定義する。その後、動物を個々のケージに戻す前に、完全な回復まで監視するヒートパッドにマウスを置きます。確立された切除創傷モデルに従って両側創傷を作成した3日後、L-012注射の前に生物発光は認められない。インニントニールL-012溶液注射後、活性酸素種が検出された創傷の領域に生物発光が認められる。60分間にわたって4〜5分間に1分間の生物発光の記録は、約50分で観察された完全なL-012飽和に達するまでの最適なイメージング時間で、時間の経過とともに関心のある領域の生物発光飽和を示しています。対象となる各創傷領域における生物発光は、L-012をナンセンスな小さな干渉RNA処理またはKeap1小干渉RNA処置マウスに注入する前および後に、その領域で光強度の総カウントを割ることによって計算することができる。H&E染色による活性酸素種レベル測定の正確性を確認するための創傷組織切片の分析は、小さな干渉性ナンセンス処理組織と比較して、小さな干渉性Keap1処置された創傷への細胞浸潤の減少を明らかにし、実験的なゲル処理動物における炎症形態の減少を示す。創傷組織切片上のタンパク質マクロファージマーカーであるF4/80の免疫反応性の分析は、小さな干渉性のキアプ1処置創傷と比較して治療された小さな干渉性Keap1のマクロファージの数が減少したことを示し、この方法の有効性をさらに下げる。この手順を試みるとき、L-012が期限切れではないことを確認し、光から保護された場所で溶液をかき混ぜるようにしてください。この手順に従って、標的プローブおよび免疫アッセイに基づく方法を使用して、活性酸素種およびその相関の細胞下局在化を研究し、創傷のリダックス統計に影響を与える介入およびメカニズムの迅速な評価を可能にする。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

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移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

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全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

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以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のCu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; PET / CTによる細胞輸送

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

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慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

創傷応答中のゼブラフィッシュ好中球中のケモカイン受容体のライブイメージング

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

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マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...