Name: in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00
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Estamos gratos ao núcleo pré-clínicos Imaging a NYU School of Medicine, com agradecimento especial a Orlando Aristizabal e Youssef Zaim Wadghiri. O núcleo é um recurso compartilhado, parcialmente apoiado pela Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center suporte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB biomédica Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de Diabetes "Caminho para parar de Diabetes" D.C. [número de concessão 1-16-ACE-08] e NYU aplicado apoio fundo de investigação para relações públicas.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da New York University School of Medicine. Todos os ratos estão alojados atrás de uma barreira e todo o pessoal usa equipamento de protecção adequado.
1. dia 0: Preparação do modelo murino de cicatrização Excisional
<ol><li>Anestesia o diabéticos ratos (Leprdb/db), com idades entre 8 a 12 semanas, com isoflurano inalatório de 2%. Confirme que cada rato tem sido devidamente...

<ol>
	<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NAD(P)H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012.">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li><li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012.">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li><li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012.">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li><li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation.">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li><li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li><li>Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing.">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li><li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche.">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals.">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li><li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li><li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+L-012,+a+luminol-based+chemiluminescent+probe,+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase:+a+reevaluation.">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds.">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li><li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing.">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li></ol>

Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA1</...

Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares1. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células, tecidos e sangue total1,2,3, 4. tem sido empregado com sucesso para a imagem latente na vivo em modelos murino para estudar várias doenças inflamatórias, incluindo artrite e colite5,6. Ainda tem que ser empregado numa ferida cutânea estabelecida modelo de cura. Medição de ROS gerado é igualmente relevante para avaliar a progressão da cicatrização de feridas em condições diferentes. A sensibilidade e a natureza não-invasiva deste método torna uma técnica promissora para estudar a cicatrização de feridas em modelos murino.
Nrf2 é um grande condutor da resposta antioxidante e um fator transcricional com especificidade para o elemento de resposta antioxidante (são) comum às regiões promotor de várias enzimas de antioxidante8. Na ausência de estresse oxidativo, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por Keap1, que posteriormente provoca sua ubiquitination e degradação. Desequilíbrio da via Nrf2/Keap1 tem sido implicado na homeostase redox inapropriado e posterior cicatrização no cenário de maior estresse oxidativo9. Anteriormente mostramos que a supressão de Keap1 estimula o aumento da atividade Nrf2 e promove resgate da cicatrização de feridas cutâneas patológica no diabético feridas9.
Aqui descrevemos um protocolo que utiliza bioluminescência L-012-assistida de imagem para medir os níveis ROS em um modelo de cura ferida cutânea excisional, que é fundamental para destacar a associação entre ROS e cicatrização de feridas. Esta técnica demonstra alterações em tempo real em carga oxidativa dentro feridas e periferia imediata. Além disso, este método permite rápida avaliação de intervenções e mecanismos de manipulação de redox que afetam. Aqui usamos um modelo de Keap1 nocaute para a restauração da homeostase redox para avaliar a aplicabilidade da nossa estratégia. Porque nossa técnica é não-invasivo e feridas são imperturbadas, o mesmo animal pode ser usado para mais confirmação análises com base em lysates histologia ou célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:265px;">BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice</td>
			<td style="width:164px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">000642</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>665581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3M Tegaderm Transparent Film Dressings</td>
			<td>3M</td>
			<td>88-1626W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keap1 Stealth siRNA</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>1299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silencer negative control&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM4635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9004-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-012</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>120-04891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C13H8ClN4NaO2) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.

Três dias depois de criar feridas bilaterais de acordo com um modelo estabelecido ferida excisional (figura 1A), ratos diabéticos estão posicionados na câmara de imagens. Uma fotografia inicial e uma medida de bioluminescência são tomadas antes da injeção de L-012 a conta para o sinal de fundo (figura 1B). Após injeção intraperitoneal com a solução de L-012, os ratos são reposicionados na câmara e bioluminescência...

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In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de reparação e regeneração de tecidos sobre as associações entre as vias citoprotetores, o estresse oxidativo e a resposta de cicatrização da ferida. A principal vantagem desta poderosa técnica é que você pode medir espécies reativas de oxigênio em uma ferida, em tempo real, para determinar seu impacto na regeneração tecidual. Demonstrando o procedimento comigo estará Jennifer Kwong, uma assistente de pesquisa no meu laboratório.Use um glucometer para medir a glicemia de cada camundongo diabético anesthetizado de oito a 12 semanas. E use um aparador de cabelo e creme depilatório para remover o cabelo dorsal do primeiro animal. Use lenços álicos duas vezes para limpar a pele exposta e cobrir o animal para que apenas a área cirúrgica seja exposta.Quando o álcool secar, use socos de biópsia estéril de 10 milímetros para criar duas feridas de espessura total de 10 milímetros que se estendem através do carnosus panniculus de acordo com uma técnica bem estabelecida de cicatrização de feridas excisionais. Use uma folha de silicone de 0,5 milímetros de espessura com recortes circulares de 10 milímetros para abrir as feridas e fixar os stints com suturas de seda interrompidas 4/0. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa, antes de retornar à sua gaiola individual, fornecendo toalhas de papel como material adicional de aninhamento por duas semanas.No dia seguinte, aplique o controle absurdo de gel RNA interferindo ou um pequeno gel Keap1 experimental interferindo no topo da ferida de cada animal e enrole cada torso com curativo de filme transparente para manter o gel no lugar enquanto deixa os membros livres. No terceiro dia do experimento, carregue uma seringa de um milímetro equipada com uma agulha de calibre 27 com solução L-012 recém-preparada e enrole a seringa para proteger a solução da luz. Para imaginar as feridas, remova suavemente o curativo transparente de cada um dos ratos sem perturbar as feridas e coloque os ratos na câmara de imagem de um sistema de imagem de bioluminescência.Defina o fluxo do sistema de imagem e os níveis de oxigênio da câmara de indução para um litro por minuto e imagem dos ratos por bioluminescência e campo brilhante na linha de base. Em seguida, limpe os abdômens com lenços umedecidos e injete cinco miligramas de solução L-012 por 200 gramas de peso corporal, IP, em cada rato uma vez que o álcool secou. Injetar a solução L-012 sem perturbar as feridas na pele dorsal é fundamental, pois qualquer distorção afetará a trajetória de cicatrização da ferida e a interpretação dos dados.Certifique-se de que o animal está seguro em recumbência dorsal antes da injeção. Imediatamente após a injeção, coloque os camundongos de volta em seus respectivos locais na câmara de imagem e imagem dos animais por um minuto a cada quatro minutos durante um período de imagem de 60 minutos, definindo a ferida de 10 milímetros como a região de interesse para determinar o nível de espécies reativas de oxigênio. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa antes de devolver os animais para suas gaiolas individuais.Três dias após a criação de feridas bilaterais de acordo com o modelo de ferida excisional estabelecida, nenhuma bioluminescência é observada antes da injeção de L-012. Após a injeção intraperintoneal da solução L-012, a bioluminescência é observada nas áreas da ferida onde espécies de oxigênio reativa são detectadas. O registro da bioluminescência por um minuto a cada quatro ou cinco minutos ao longo de 60 minutos demonstra a saturação bioluminescente da região de interesse ao longo do tempo, com o tempo ideal de imagem para alcançar a saturação L-012 completa observada em cerca de 50 minutos.A bioluminescência em cada região de interesse de ferida antes e depois da injeção de L-012 em pequenos RNAs interferentes ou camundongos tratados com RNA interferentes keap1 podem então ser calculados dividindo as contagens totais de intensidade de luz pela área. A análise das seções de tecido silvestre do dia 10 para confirmar a precisão da medição do nível de nível de espécies de oxigênio reativos pela coloração de H&E revela uma redução da infiltração celular em pequenas feridas tratadas keap1 interferindo em comparação com pequenos tecidos tratados sem sentido interferindo, indicando uma morfologia inflamatória reduzida nos animais experimentalmente tratados com gel. A análise da imuno-reatividade de F4/80, um marcador de macrófago proteico em seções de tecido silvestre, indica um número reduzido de macrófagos em pequenas feridas tratadas keap1 interferentes em comparação com pequenas feridas tratadas sem sentido interferindo, ressaltando ainda mais a validade deste método.Ao tentar este procedimento, certifique-se de confirmar que o L-012 não está expirado e agitar a solução em um lugar protegido contra a luz. Após este procedimento, sondas direcionadas e métodos baseados em imuno-ensaio podem ser usados para estudar a localização subcelular de espécies reativas de oxigênio e seus correlatos, permitindo uma rápida avaliação das intervenções e mecanismos que afetam as estatísticas redux das feridas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

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Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

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Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

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Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...