Name: immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines
Uploaded: 2018-10-30T14:45:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines at JoVE.com

الكتاب ممتنون لأعضاء الفريق المعني ببحوث تجريبية في علم المناعة، وخاصة إلى ماكينن لينا وبيبو هانالينا، لكل عمل قاموا به في تطوير وتحسين بروتوكول التطعيم، ومساعدتهم في التجارب الفعلية استخدام البروتوكول.
هذا العمل وأيده جا جين آتوس أركون Säätiö (مؤسسة أركو آتوس؛ وجين لمحمد)، سيغريد Juséliuksen Säätiö (سيغريد جوسيليوس مؤسسة؛ لمحمد)، "تمويل البحوث الدولة التنافسية" لمنطقة "مسؤولية الخبراء" من جامعة تامبيري مستشفى (لمحمد)، Tuberkuloosisäätiö تامبيرين (مؤسسة السل تامبيري؛ وإلى محمد، صاحب الجلالة، ورائد)، كولتووريراهاستو سومن (المؤسسة الثقافية الفنلندية؛ لصاحب الجلالة)، سومن توبيركولوسين فاستوستاميسيهديستيكسين Säätiö (المضادة للسل الفنلندية مؤسسة؛ لصاحب الجلالة)، جا فاينو كيفين لاينا säätiö (فاينو ولاينا مفعوله مؤسسة؛ لرائد) و "مؤسسة العلوم مدينة تامبير" (لرائد).

<ol>
	<li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response.">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).</li><li>Tregoning, J. S., Kinnear, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Plasmids+as+DNA+Vaccines+for+Infectious+Diseases.">Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Evensen, O., Leong, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+against+viral+diseases+of+farmed+fish.">DNA vaccines against viral diseases of farmed fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).</li><li>Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vaccine+directed+against+a+rainbow+trout+rhabdovirus+induces+early+protection+against+a+nodavirus+challenge+in+turbot.">A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot.</a> Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).</li><li>Li, L., Petrovsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+for+enhanced+DNA+vaccine+immunogenicity.">Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).</li><li>Embregts, C. W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+DNA+Vaccination+of+Juvenile+Carp+against+Spring+Viremia+of+Carp+Virus+Induces+Full+Protection+and+Establishes+a+Virus-Specific+B+and+T+Cell+Response.">Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).</li><li>Lorenzen, N., LaPatra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+for+aquacultured+fish.">DNA vaccines for aquacultured fish.</a> Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).</li><li>Oksanen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+zebrafish+model+for+preclinical+tuberculosis+vaccine+development.">An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development.</a> Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).</li><li>Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+as+a+predominant+mechanism+for+inducing+CD8(+)+T+cell+responses+in+gene+gun+DNA+immunization.">Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization.</a> The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).</li><li>Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+antigen+presenting+cells+in+zebrafish.">Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).</li><li>Shao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+surface+phenotypic+molecules+of+teleost+dendritic+cells.">Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).</li><li>Utke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+immune+responses+in+rainbow+trout+after+DNA+immunization+against+the+viral+hemorrhagic+septicemia+virus.">Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).</li><li>Cuesta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+DNA+vaccine+against+infectious+pancreatic+necrosis+virus+(IPNV)+with+a+different+mode+of+action+than+fish+rhabdovirus+DNA+vaccines.">An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines.</a> Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).</li><li>Castro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+against+a+fish+rhabdovirus+promotes+an+early+chemokine-related+recruitment+of+B+cells+to+the+muscle.">DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle.</a> Vaccine. 32 (10), (2014).</li><li>Iwanami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+understanding+the+evolution+of+the+vertebrate+immune+system+and+human+primary+immunodeficiency.">Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).</li><li>Patterson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+model+of+bacterial+meningitis+in+Streptococcus+agalactiae+infection.">Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).</li><li>Cronan, M. R., Tobin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fit+for+consumption:+zebrafish+as+a+model+for+tuberculosis.">Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis.</a> Disease Model &amp; Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Parikka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+causes+a+latent+infection+that+can+be+reactivated+by+gamma+irradiation+in+adult+zebrafish.">Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish.</a> PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).</li><li>Rounioja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defense+of+zebrafish+embryos+against+Streptococcus+pneumoniae+infection+is+dependent+on+the+phagocytic+activity+of+leukocytes.">Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).</li><li>Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Breathes+New+Life+into+the+Study+of+Tuberculosis.">The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis.</a> Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).</li><li>Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Myllymaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antigen+candidates+for+a+tuberculosis+vaccine+in+the+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).</li><li>Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+postexposure+mycobacterial+vaccine+antigens+using+an+immunosuppression-based+reactivation+model+in+the+zebrafish.">Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish.</a> Disease Model &amp; Mechanisms. 11 (3), (2018).</li><li>Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+for+targeting+bacterial+infections.">DNA vaccines for targeting bacterial infections.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+AUG+and+alternative+initiator+codons+is+augmented+by+G+in+position++4+but+is+not+generally+affected+by+the+nucleotides+in+positions++5+and++6.">Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6.</a> The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Charan, J., Kantharia, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+calculate+sample+size+in+animal+studies?.">How to calculate sample size in animal studies?.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).</li><li>Hammaren, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adequate+Th2-type+response+associates+with+restricted+bacterial+growth+in+latent+mycobacterial+infection+of+zebrafish.">Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish.</a> PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).</li><li>Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+adult+zebrafish.">Electroporation of adult zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 423, 289-298 (2008).</li><li>McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles:+an+innovative+platform+for+gene+delivery.">Microneedles: an innovative platform for gene delivery.</a> Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).</li><li>Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+study+of+in+situ+expression+of+antigens+following+DNA-vaccination+against+VHS+in+rainbow+trout+(Oncorhynchus+mykiss+Walbaum)+fry.">Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry.</a> Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).</li><li>Oksanen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+Model+for+Studying+DNA-based+Vaccination+against+Mycobacterial+Disease.">Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease.</a> Tampereen yliopisto. , (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الداخلي لتحصين الزرد الكبار مع لقاحات الحمض النووي القائم يتطلب بعض الخبرة التقنية. وحتى بالنسبة باحث ذوي خبرة، تطعيم سمكة واحدة يأخذ حوالي 3 دقيقة، باستثناء الأعمال التحضيرية. وهكذا، يمكن تحصين كحد أقصى أسماك ما يقرب من 100 خلال يوم واحد. إذا كانت الأسماك أكثر من 100 مطلوبة للتجربة، يمكن تقسيم التحصينات بين مدة تصل إلى 3 أيام. بالإضافة إلى نوعية التجربة، التدريب الكافي من researcher(s) لمناولة الأسماك والقيام التحصين أساسي لرفاه الأسماك. تأكد من اتباع قواعد الرعاية القانونية والحيوانات المحلية والمبادئ التوجيهية عندما يتعلق الأمر إلى السكن في الأسماك، والتخطيط التجارب، والمؤهلات المطلوبة للعاملين الذين يقومون بالتجارب.
وباختصار، هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتجنب التعقيدات في البروتوكول التحصين. لتحصين ناجحة، التأكد من أن 1) الأسماك تحصين سليمة وكافية في العمر والحجم (يمكن أن تتطلب تحصين أكثر الأسماك أسفل تحجيم حجم اللقاحات وإعدادات انهانسر)؛ 2) الأسماك يتم تخديره بشكل صحيح مع عدم وجود أقوى من 0.02% 3-امينوبنزويك إيثيل حمض إستر، وأنها لا تزال أنيسثيتيزيد طوال الإجراءات بأكملها (التخدير ينبغي أن تظل قصيرة قدر الإمكان ضمان استرداد الأسماك)؛ 3) وسادة الأسفنج يتم استيعابه بشكل صحيح؛ 4) يتم حقن السائل في كل نبض من مضخة تعمل بالهواء المضغوط، وإذا لم يكن كذلك، يتم ضبط طول النبضة (سحب الإبرة إلى الوراء قليلاً على طول المحور الصادي يمكن أن تساعد)؛ 5) هناك لا فقاعات الهواء مع حل اللقاح؛ 6) الإعدادات انهانسر والجهد نبض الفعلية وطول الصحيحة؛ 7) الأقطاب لا تسبب تلف الجلد على الموقع انهانسر (خلال انهانسر، إبقاء أقطاب كهربائية في لطيف الاتصال مع السمك، والإفراج عن الأسماك فورا إلى الخزان الانتعاش بعد انهانسر).
من المهم رصد الأسماك بعد انهانسر في خزان الانتعاش وأن euthanize الأسماك أي دلائل على عدم الراحة. وعلاوة على ذلك، من الضروري لممارسة هذا الإجراء قبل بدء إجراء تجربة على نطاق واسع، لضمان سير عمل بطلاقة. إذا كان ذلك ممكناً، أطلب من زميل مدربين بما فيه الكفاية للمساعدة في ملء الإبر وانهانسر.
طريقة تلقيح الحمض النووي يتيح تصميم مصممة خصيصا لمولدات المضادات اللقاحات. من الممكن استنساخ مستضد كله، أو يفضل، تحديد أجزاء من مستضد استناداً إلى الترجمة والاستمناع الخلوية24. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح الأسلوب الجمع بين عدة مولدات المضادات أو المواد المساعدة في بناء لقاح واحد أو الحقن عدة والبلازميدات منفصلة في نفس الوقت2. بما في ذلك كودون توقف بعد تسلسل مستضد أو نسق الجين اجفب من بلازميد، أنه من الممكن استخدام ناقلات بلازميد نفسه أيضا التعبير عن المستضد دون علامة التجارة والنقل الطرفي ن اللاحقة. وهذا قد يكون من المعقول في تأكيد نتائج الفحص إيجابية، الحجم الكبير نسبيا للتجارة والنقل يمكن أن تؤثر على طي antigen، وهكذا، تقييد استجابات خلطيه يحتمل أن أثارت قبل التلقيح.
ارتبط تعبير مستضد أعلى للحمض النووي لقاح الاستمناع2. انهانسر بعد الحقن، وبالتالي، قد أدرج في هذا البروتوكول، كما أنه ثبت لزيادة التعبير عن المستضدات أو الجينات مراسل من أربعة إضعاف إلى عشرة إضعاف في الزرد32. وعلاوة على ذلك، انهانسر كأسلوب يسبب إصابة نسيج معتدلة، مما حمل التهاب المحلية التي تشجع زيادة الاستجابات المناعية الناجمة عن اللقاحات2. من ناحية أخرى، انهانسر عموما جيد التحمل. عمليا مع المعدات المستخدمة هنا، سوف استرداد 100% الزرد الكبار جيدا من البقول ست من 40 الخامس المستخدمة في هذا البروتوكول35.
بالإضافة إلى استخدام انهانسر لتعزيز دخول بلازميد اللقاح في الخلايا، نستخدم مروج في كل مكان قوي في بلازميد اللقاح وذيل بوليا في نهاية 3 ' antigen لتحسين التعبير مستضد في خلايا الأسماك ترانسفيكتيد. وفي بعض الحالات، إذا كان استخدام كودون الممرض الهدف يختلف إلى حد كبير الأنواع الملقحين، التحسين كودون قد وجد مفيدة في زيادة التعبير الجيني الهدف2. في هذا الزرد-النموذجM. marinum ، بيد كودون الأمثل ليس أثر كبير على مستويات التعبير من اثنين من الجينات نموذج المتفطرات، ESAT-6 و 10-الحراجية المعتمدة، و، وبالتالي، كانت تعتبر غير ضرورية في هذا النموذج35 .
التشكيلات الجانبية لتعبير الجينات المستهدفة لديها بعض التغير الزمني بين مولدات المضادات، تبعاً، على سبيل المثال، الحجم وهيكل مولدات المضادات في السؤال. ومع ذلك، التعبير مستضد يشبه عادة ضمن مجموعة من الأسماك تحصينهم باللقاح نفسه. بشكل عام، يلاحظ التعبير اجفب ألمع أربعة أيام إلى أسبوع واحد بوستفاكسينيشن، ولكن مقياس من 2 – 10 أيام ممكن. من المستحسن التحقق من صحة التعبير عن كل البروتين الانصهار مستضد اجفب في مجموعة صغيرة من الأسماك (2-3) قبل بما في ذلك antigen في تجربة واسعة النطاق. إذا لوحظ أي تعبير بروتينات فلورية خضراء في أي نقطة 2 – 10 أيام بعد التطعيم، تأكد من أن 1) البروتوكول التحصين وأعقب بعناية. دائماً مجموعة من الأسماك تحصين مع بلازميد اجفب بكمف الفارغة كعنصر إيجابي وتأكد من أن 2) تصميم مستضد والاستنساخ الجزيئي وقد نفذت بشكل صحيح (التصميم التمهيدي الملائم؛ والمستضد والعلامة اجفب على حد سواء في نفس إطار القراءة ولا codons وقف التدخل مدرجة). وفي بعض الحالات، على الرغم من تصميم مستضد الصحيحة، لا يمكن الكشف عن التجارة والنقل. قد يكون هذا نتيجة غير صحيحة قابلة للطي أو انهيار سريع للبروتين الانصهار. وفي هذه الظروف، قد يكون من الضروري على إعادة تصميم antigen.
في اللقاحات المستخدمة في تحصين الأسماك المستزرعة، هو بلازميد الجرعة المستخدمة عادة 1 ميكروغرام أو أقل7،،من3334. في الزرد، يمكن أيضا اكتشاف الجينات مراسل بعد حقن بلازميد 0.5 ميكروغرام على الأقل عقب انهانسر؛ ومع ذلك، التعبير الجيني الهدف النسبي زيادة كبيرة بكمية أعلى من بلازميد كل الأسماك (تكميلية الشكل 1). في الأسماك حقن مع بلازميد مراسل بكمف-اجفب، أدى حقنه مع 5-20 ميكروغرام من بلازميد أربعة إلى ثمانية إضعاف اجفب أعلى المستويات مقارنة بالأسماك حقن 0.5 ميكروغرام. ولذلك، ضمان تعبير جين المستهدف عالية بما يكفي، ولكن لديها وحدات الحقن التي هي صغيرة بما يكفي (دي سيفن ميليلتر) لمنع أي ضرر الأنسجة الزائدة أو تسرب اللقاح، اخترنا لاستخدام 5 إلى 12 ميكروغرام كل الأسماك لأغراض الفرز الأولى. بالإضافة إلى لقاح الاستمناع، عالية ما يكفي التعبير الجيني المستهدف مطلوب للكشف عن الجينات مراسل مع مجهر الأسفار ولطخة غربية، وهو ضروري لأغراض تأكيد الصحيحة في فيفو الفرز ترجمة مستضد المستهدفة. ولكن بلازميد أقل جرعات (0.5 – 1 ميكروغرام) يمكن أن تكون مفيدة لأنواع أخرى من الاستخدامات التجريبية.
وفي الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحصين الزرد الكبار مع بلازميد الحمض النووي في الاختبار السريري المرشحين رواية لقاح ضد الالتهابات البكتيرية أو الفيروسية المختلفة. يتيح التعبير عن مستضد لقاح بروتين بروتينات فلورية خضراء-انصهار التصور من تعبير الحدث ومستضد التحصين الناجح. نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للفحص السريري للمرشحين مستضد لقاح جديد ضد السل. لهذا، نحن تصيب بوستفاكسينيشن خمسة أسابيع الزرد وتحديد التهم البكتيريا في كل الأسماك مع قبكر،من2024.

وأجريت دراسات لقاحات الحمض النووي الأول في التسعينات1، ومنذ ذلك الحين، تم اختبار لقاحات الحمض النووي ضد مختلف الأمراض المعدية، والسرطان، والمناعة الذاتية، والحساسية2. في الثدييات، وقد تم ترخيصها بالحمض النووي لقاح ضد فيروس غرب النيل في الخيول ولقاح سرطان علاجية لسرطان الجلد عن طريق الفم الكلاب البوليسية، ولكن هذه ليست حاليا في الاستخدام السريري2. بالإضافة إلى الاهتمام الذي أثارت من قبل دراسات الثدييات، تحولت تلقيح الحمض النووي لتكون وسيلة مريحة لتحصين الأسماك المستزرعة ضد الأمراض الفيروسية. لقاح ضد فيروس نخر المكونة للدم المعدية الأسماك (إيهنف) قد تم في الاستخدام التجاري منذ عام 2005، ولقاح ضد فيروس نخر البنكرياس المعدية (التنكرز) مؤخرا مرخصة3. وباﻹضافة إلى ذلك، يجري تطوير لقاحات الحمض النووي عدة ضد مسببات أمراض الأسماك.
غالباً ما تحتوي اللقاحات التقليدية على مسببات الأمراض الموهنة المعطل أو حية، أنها تشكل خطرا محتملاً لنقل المرض2. لقاحات الحمض النووي، وفي المقابل، تجنب هذا الخطر، حيث أنها تقوم على إدارة بلازميد ترميز مولدات المضادات البكتيرية أو الفيروسية، بدلاً من مسببات المرض كله نفسها2،4. ويتم إنتاج لقاحات الحمض النووي مع تقنيات جزئ الحمض النووي، الذي يتيح تصميم دقيق من مولدات المضادات اللقاحات وصياغة مرنة من تركيبات مستضد والمواد المساعدة في بناء لقاح واحد5. وعلاوة على ذلك، إنتاج لقاحات الحمض النووي أسرع وأسهل وأكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة باللقاحات المؤتلف القائم على البروتين، وميزة كبيرة لمرشح لقاح أغراض الفرز، ولكن أيضا، على سبيل المثال، في حالة تفشي الوباء 2.
في الأسماك وطرق الإدارة الأكثر شيوعاً للقاحات الحمض النووي داخل والعضلي، وعن طريق الفم3،6،،7بينما في الثدييات، تحت الجلد وطرق الأدمة هي خيارات إضافية2. بعد حقنه عضليا، أدخل والبلازميدات الحمض النووي مقاتلا الخلايا في موقع الإدارة (مثلاً.، معظمهم myocytes، بل أيضا المقيمين تقديم مستضد خلايا [ناقلات الجنود المدرعة]). يمكن زيادة كبيرة في نسبة الخلايا transfected انهانسر2،8. بعد دخول الخلية، يدخل بعض بلازميد الحمض النووي النواة، التي تكون فيها الجينات المشفرة بواسطة بلازميد يدون2. في هذا البروتوكول، فنحن نستخدم بلازميد بكمف-اجفب يحتوي على أحد المروجين في كل مكان قوي الأمثل للتعبير التوكسينات9. في هذا البناء، تترجم مولدات المضادات بروتين انصهار مع بروتينات فلورية خضراء. التجارة والنقل يمكن تأكيد تطعيم ناجحة والمنتج الصحيح مستضد بالتصور البسيط للتعبير مستضد مع مجهر الأسفار في الأسماك الحية.
في الثدييات، أظهرت لقاحات الحمض النووي لتحفيز أنواع مختلفة من الاستجابات المناعية اعتماداً على أنواع الخلية transfected2،5. Transfected myocytes تفرز مولدات المضادات في الفضاء خارج الخلية أو الإفراج عنهم عند موت الخلية، والمستضدات غارقة بناقلات الجنود المدرعة، فيما بعد، وتعرض على histocompatibility الرئيسية المعقدة ثانيا الجزيئات2. هذا بتشغيل استجابات الخلايا CD4 وتي CD8، خاصة، بالإضافة إلى الخلية بالردود2،،من510. في الأسماك، اللمفاويات T و B، فضلا عن الخلايا الجذعية (DCs)، وقد حددت، حتى الآن على تقسيم العمل في مستضد العرض التقديمي هو أقل تفهماً جيدا11. قد ثبت DCs الزرد، بيد أن حصة المصانة السمات المظهرية والوظيفية مع نظرائهم الثدييات على12. وعلاوة على ذلك، قد تبين تلقيح الحمض النووي للحصول على الاستجابات المناعية مماثلة في الأسماك والثدييات، بما في ذلك تي وخلية بالردود6،13،،من1415،16 .
تستخدم على نطاق واسع كل من اليرقات والكبار الزرد إلى نموذج مختلف الأمراض المعدية، مثل M. marinum الأسماك نموذج عدوى السل المستخدمة في هذا البروتوكول17،،من1819،20 ،،من2122. بالمقارنة مع الكائنات نموذج الثدييات، ومزايا الزرد تشمل حجمها صغير، وإمكانية تكرار نتائج سريعة، وانخفاض الإسكان نفقات23. تجعل هذه الجوانب الزرد نموذج حيوان مثالي لدراسات الفحص السريري واسعة النطاق للقاحات جديدة والمركبات الصيدلانية23،،من2425.
في هذا البروتوكول، يصف لنا مستضد لقاح الرواية كيف يمكن تقييم المرشحين ضد ميكوباكتيريوسيس بتلقيح الحمض النووي القائم الزرد الكبار. أولاً، نحن تصف كيف يتم استنساخ المستضدات إلى بلازميد التعبير بكمف-اجفب، تليها بروتوكول مفصل للحقن العضلي والبلازميدات اللقاح وانهانسر اللاحقة في العضلات. التعبير عن كل مستضد ما تؤكده الأسفار مجهرية بوستيمونيزيشن مدة أسبوع واحد. ثم يتم اختبار كفاءة المرشحين مستضد من إصابة تطعيم الأسماك مع M. marinumتجريبيا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pCMV-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475-2L</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02445.2500</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Pulling of needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet PCR Purification kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP ELISA kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td>AKR-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate (FW 118.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>imagej.net/Downloads</td>
			<td></td>
			<td>freely available software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MA-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AZ100</td>
			<td>fluorescense microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ZS61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>E404-200TABL.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114537-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV830 Phneumatic Pico Pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>ID:12163</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (FW294.1)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27833.294</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Inc.</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040-100g</td>
			<td>anestesia and euthanasia solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base) (FW121.14)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX 450165</td>
			<td>tweezer type electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mmCeramic beads</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646-3</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Tough tubes with caps</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-649</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate capillaries</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 20 &#181;l</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 16 mm</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swan Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td>laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam workbench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines

تزايد الاهتمام في التلقيح على أساس الحمض النووي خلال العقدين الماضيين. تلقيح الحمض النووي يقوم على استنساخ تسلسل مستضد محدد أو مجموعة من مولدات المضادات في بلازميد، التي تمكن من تصميم مصممة خصيصا وآمنة. إدارة لقاحات الحمض النووي داخل الخلايا المضيفة يؤدي إلى التعبير عن المستضدات التي تحفز الاستجابات المناعية خلطيه وخلية بوساطة. ويصف هذا التقرير بروتوكول لاستنساخ التسلسلات مستضد في بلازميد بكمف-اجفب، تحصين الزرد الكبار مع المرشحين لقاح microinjection العضلي، وانهانسر اللاحقة لتحسين المدخول. يتم التعبير عن المستضدات اللقاح بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-الانصهار والبروتينات، والذي يسمح لتأكيد التعبير مستضد تحت ضوء من الأسماك الحية والتحديد الكمي لمستويات التعبير من البروتين الانصهار مع أليسا، كذلك كالأشعة فوق البنفسجية الكشف عنها بتحليل لطخة غربية. يتم اختبار تأثير المرشحين اللقاحات الواقية من إصابة الأسماك بكتريا مارينوم بوستفاكسينيشن خمسة أسابيع، متبوعاً بالتحديد الكمي للبكتيريا مع قبكر بعد أربعة أسابيع. بالمقارنة مع نماذج الفحص السريري الثدييات، يوفر هذا الأسلوب طريقة فعالة من حيث التكلفة لفحص أولى للمرشحين رواية لقاح الحمض النووي القائم ضد مرض المتفطرات. يمكن تطبيق الأسلوب كذلك إلى فحص الحمض النووي القائم اللقاحات ضد الأمراض البكتيرية والفيروسية المختلفة.

الخطوات المتبعة في البروتوكول تلقيح الحمض النووي من الزرد الكبار موضحة في الشكل 3. في البداية، يتم استنساخ في تسلسل مستضد المحدد إلى بلازميد بكمف-اجفب وبلازميد الحمض النووي يتم إنتاجه وتنقيته24 (الشكل 3). ثم يتم حقن اللقاحات المرشحين عضليا مع ميكروينجيكتور وهو موقع الحقن اليكتروبوراتيد لتحسين مدخول بلازميد داخل الخلايا (الشكل 3). وكان الأمثل جرعة تطعيم المستخدمة بكميات مختلفة من بلازميد بكمف-اجفب بالحقن وقياس التعبير بروتينات فلورية خضراء مع أليسا (الملحق الرقم 1). اثنين لمدة سبعة أيام بوستفاكسينيشن، التعبير عن البروتين الانصهار يتم الكشف عنها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتصور مع الأسفار مجهرية (رقم 3 و رقم 4). قد تختلف مستويات التعبير من مولدات مختلفة جداً مكثفة (مستضد 1) إلى تعبير خافت (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة التعبير التجارة والنقل عبر العضلات الظهرية (مستضد 1)، أو في منطقة محدودة أكثر (مستضد 2) (الشكل 4). ومع ذلك، إذا تم الكشف عن لا الأسفار في غضون عشرة أيام، من المستحسن للتأكد من أنه لا توجد أية أخطاء في تصميم مستضد الاستنساخ أو التمهيدي. لتأكيد أن البروتين الانصهار المعرب عنها بالحجم الصحيح، يمكن استخراجه من الأنسجة العضلية حول مكان الحقن البروتينات وتستخدم لتحليل لطخة غربية.
يتم تقييم تأثير المرشحين اللقاح بتحدي السمك مع جرعة منخفضة من M. marinum بحقنه داخل (الشكل 5). بوستينفيكشن أربعة وخمسة أسابيع، التهم البكتيرية مصممون مع قبكر ومقارنة أحمال البكتيرية في السيطرة على المجموعة (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار فعالية المرشحين اللقاحات الواعدة أكثر من غيرها بالرصد البقاء على قيد الحياة بعد جرعة عالية العدوى مارينوم م. (الرقم 5). ولكن بالإضافة إلى إعطاء نتيجة كمية في تطور العدوى، بدلاً من مجرد حالة حيا أو ميتا، التحديد الكمي على أساس qPCR زيمبابوي يتطلب وقتاً أقل وأصغر مجموعة أحجام وهو، لذلك، اتباع نهج أكثر أخلاقية للابتدائي الشاشة. وعموما، هذا البروتوكول يسهل فحص فعالية لقاح الرواية مولدات المضادات في غضون 12 أسبوعا (الشكل 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig1.jpg"> الشكل 1: عن قرب (12 س) ألومينوسيليكات الإبر المستخدمة في الحقن داخل العضلات الزرد الكبار- تلميح أدناه فقد تم خفض مع ملاقط وجاهزة للاستخدام ميكروينجيكتيونس. وهذا الرقم تم تكييف من أوكسانين35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig2.jpg"> رقم 2: Microinjection المعدات والإنشاء- يتم تمييز المكونات الرئيسية للمعدات اللازمة لتلقيح الحمض النووي الزرد الكبار بخط غامق. وترد التعديلات الهامة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig3.jpg"> الشكل 3: إعداد والبلازميدات لقاح الحمض النووي وإجراءات التحصين. يتم استنساخ المستضدات (1) المحددة المتاخمة للعلامة التجارة والنقل في بلازميد بكمف-اجفب. بناء (2) اللقاح أنتج مجهريا، وتتركز، وتنقيته. ميكروغرام (3) 12 من بلازميد يحقن في العضلات الظهرية من الزرد الكبار أنيسثيتيزيد مع ميكروينجيكتور، والحقن في وقت لاحق اليكتروبوراتيد مع ستة 40-V، 50--مرض التصلب العصبي المتعدد البقول. (4) بوستفاكسينيشن يومين إلى سبعة أيام، تعبير بروتينات فلورية خضراء من البروتين الانصهار مستضد-التجارة والنقل هو تصور مع مجهر الأسفار. (5) فلوري جزء من العضلات الظهرية يمكن تشريح وتستخدم لاستخراج البروتين. ويؤكد حجم البروتين الانصهار مع إجراء تحليل لطخة غربية ومستوى التعبير مع بروتينات فلورية خضراء-أليسا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2.jpg"> الشكل 4: تصور التعبير عن البروتين الانصهار مستضد-اجفب- يتم تطعيم تخديره الزرد الكبار مع 12 ميكروغرام لقاحاً تجريبيا المستضدات (مستضد 1 – 3) والحقن هو اليكتروبوراتيد، وفي وقت لاحق، مع ستة 40 الخامس، البقول 50 مللي ثانية. اثنين لمدة سبعة أيام بوستفاكسينيشن، موقع الحقن يتم تصويرها مجهر. أولاً، يتم الكشف عن التعبير عن التجارة والنقل تحت مجهر الأسفار. ويتم تفتيش المنطقة استخدام هدفا حجم X 2 وتصويرها وحفظها في شكل.tiff. يتم دمج صورة مجهر الضوء بنفس المنطقة مع الصورة الفلورية باستخدام البرمجيات إيماجيج. قد تختلف كمية وموقف التعبير مستضد بين المستضدات والأسماك الفردية. على سبيل المثال، التعبير عن مستضد 1 الملاحظ عبر العضلات الظهرية والتعبير عن مستضد 2 يعتبر بقع صغيرة، في حين مستضد 3 بقوة بمنطقة محدودة أكثر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig5.jpg"> الرقم 5: اختبار فعالية المرشحين لقاح ضد مرض المتفطرات. (1) بالغ الزرد يلقح مع لقاحات الحمض النووي التجريبي ضد ميكوباكتيريوسيس. (2) خمسة أسابيع بوستفاكسينيشن، يصاب السمك مع جرعة منخفضة من بكتريا مارينوم (~ 30 زيمبابوي). تشريح الأجهزة (3) أربعة أسابيع في وقت لاحق، الداخلية وتستخدم لاستخراج الحمض النووي. (4) العد البكتيري في كل الأسماك هو كمياً باستخدام مارينوم م.قبكر--الإشعال محددة. وكان التحصين مع مستضد 1 أدت إلى انخفاض كبير في التهم البكتيرية (ف < 0.01، ANOVA ثنائي الاتجاه)، بينما المستضدات 2 و 3 أي تأثير. كذلك يتم تقييم تأثير (5) الحماية المرشح اللقاحات الواعدة (مستضد 1) في تجربة البقاء على قيد الحياة، حيث يصاب السمك بجرعة عالية (~ 10,000 زيمبابوي) من البكتيريا ويتم رصد البقاء على قيد الحياة لمدة 12 أسبوعا. لاحظ تمشيا مع الانخفاض في عبء البكتيرية في لوحة 4، التطعيم مع مستضد 1 أيضا تحسين بقاء الأسماك على عدوى M. marinum (ف < 0.01)، مما يوحي بهذا المستضد يمكن أن تكون مبشرة بالخير مرشح عن لقاح جديد ضد السل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/58453/58453figS1.jpg"> التكميلية الرقم 1: مقدار بلازميد الحمض النووي يؤثر على التعبير اجفب المستمدة من بلازميد في الزرد الكبار- مجموعات من الأسماك (n = 5 في كل مجموعة) تم حقن 0.5 – 20 ميكروغرام من بكمف-اجفب، وكان يستخدم انهانسر (ست نبضات من 50 الخامس) لتعزيز تعداء. تم حقن الأسماك التحكم (CTRL) مع 2 ميكروغرام من بلازميد بكمف فارغ لا يحتوي على الجينات اجفب. بروتينات فلورية خضراء-أليسا كان يؤديها 3 أيام بوستينجيكشن تعريف تعبير اجفب النسبية في هوموجيناتيس السمكية. فالقيم: *ف < 0.03، * *ف < 0.004. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. NS = ليس كبيرا. وهذا الرقم تم تكييف من أوكسانين35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453figS1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines at JoVE.com

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

تحصين الزرد الكبار للفحص السريري للقاحات الحمض النووي القائم

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتحصين الزرد الكبار (دانيو rerio) بلقاح على أساس الحمض النووي وإثبات التحقق من صحة الحدث التطعيم الناجحة. هذا الأسلوب مناسبة لفرز المرشحين اللقاح في نماذج مختلفة من العدوى الإكلينيكية.

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

نحن نستخدم هذا البروتوكول للبحث عن مرشحين لقاحات جديدة ضد السل، ولكن يمكن تطبيقي على الأمراض المعدية الأخرى. وبالمقارنة مع نماذج الثدييات، توفر هذه الطريقة إجراءً فعالاً من حيث التكلفة للفحص الأولي لمرشحين لقاحات جديدة تعتمد على الحمض النووي. إثبات الإجراء سيكون هانالينا بيببو، فني من مختبرنا.للبدء، تعيين الشعيرات الدموية الزجاجية في الخامس الأخدود في شريط القطبية وتشديد مقبض لقط طفيفة. نقل حامل بجانب خيوط ودفع بلطف الشعرية من خلال خيوط وإلى شريط القطبية على الجانب الآخر من خيوط. المقبل، وتشديد المقابض لقط، تعيين أسفل الزجاج السلامة، واضغط على زر السحب.بعد ذلك، ضع الإبر على قطعة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام داخل طبق بيتري لحماية نصائح الإبرة. أولاً، إعداد مزيج الحقن باستخدام 0.5 إلى 12 ميكروغرام من البلازميد لكل جرعة. إعداد الحجم المناسب من المزيج الرئيسي لعدد الأسماك في المجموعة.ضع الإبرة الشعرية على الجانب اللزجة من قطعة من الشريط على حامل مناسب. المقبل، قطرات ماصة من جرعات البلازميد على قطعة من فيلم المختبر. بعد ذلك، استخدم تلميح التحميل لنقل قطرات البلازميد من الفيلم إلى الإبرة.الماصات ببطء وبعناية لتجنب فقاعات الهواء الأنابيب في الإبرة. ضع المتلاعب الصغير ومصدر الضوء. ثم قم بتبديل ضغط الهواء إلى الموضع المفتوح.على اللوحة الأمامية حاقن الصغرى ضبط طول النبض إلى 10 ثانية باستخدام وضع الوقت. ثم، ضبط طول النبضة بدقة باستخدام قرص فترة 10-turn. المقبل، تعيين الإبرة على حامل ماصة صغيرة من المتلاعب الصغرى.استخدم ملاقط لقطع طرف الإبرة للسماح بدفع السائل للخارج، واستخدم المجهر لتقييم موضع الإبرة. اضغط على مفتاح القدم عن بعد مرة واحدة للتحقق من أن نبضة ثانية واحدة تدفع قطرة صغيرة من الإبرة. ثم ضبط إعدادات electroporator وربط الملاقط إلى electroporator.للحفاظ على السمك في وضع ثابت أثناء الحقن استخدام قطعة من الاسفنج مع قطع الأخدود في منتصف كما الحشو. نقع الاسفنج جيدا في المياه النظام ووضعها في طبق بيتري. باستخدام ملعقة بلاستيكية، نقل حمار وحشي تخدير إلى الإسفنج الرطب مع الجانب البطني للأسماك أسفل في الأخدود.تحت المجهر وضع الإبرة في زاوية 45 درجة على مقربة من العضلات الظهرية في سمك الحمار الوحشي، ثم العثور على بقعة صغيرة دون جداول أمام زعنفة الظهر ودفع الإبرة في العضلات. إذا كان يشعر أي مقاومة محاولة بقعة المجاورة. استخدام مفتاح القدم لحقن تدريجيا حل البلازميد في العضلات.تحت المجهر يجب أن يكون أحمر الفينول مرئيًا عند دخوله إلى الأنسجة العضلية. الكهربائي الأسماك مباشرة بعد الحقن عن طريق وضع أقطاب من نوع المقطط في كل جانب من موقع الحقن. اضغط على زر البدء على electroporator واعطاؤه ست نبضات 40 فولت 50 مللي ثانية.ثم، نقل بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش. وأخيرا، بعد اصطيد الأسماك وفقا لبروتوكول النص، واستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لرؤية التعبير EGFP بالقرب من موقع الحقن. في هذا البروتوكول، تم استنساخ مستضدات الحمض النووي المجاورة لGFP في متجه التعبير.تم حقن سمك الحمار الوحشي مع الحمض النووي المستضد البلازميدات داخل العضل مع حاقن الصغيرة، وكان موقع الحقن الكهربائي لتحسين تناول البلازميدات في الخلايا. للتصوير، يمكن تصور التعبير المستضد مع المجهر الفلوريس. في هذه الحالة، تم الكشف عن التعبير عن جميع البروتينات الانصهار المستضدية 2000 بالقرب من موقع الحقن، على الرغم من أن شدتها تختلف.بعد خمسة أسابيع من التحصين مع المستضدات الفطرية تم إصابة حمار وحشي مع ماراتينوم الميكوبتريا. وقد استُخدم هذا المرض لتحديد العبء البكتيري في كل سمكة بعد أربعة أسابيع من الإصابة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، وأظهرت الأسماك المحصنة مع مستضد واحد انخفاض الأحمال البكتيرية بعد العدوى مع M.marinum.أثناء تنفيذ هذا الأسلوب من المهم تصميم بناء البلازميد بعناية، والتحقق من صحة التعبير عن المستضد، وممارسة تقنية الحقن قبل التجارب على نطاق واسع. يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق لفحص فعال من حيث التكلفة قبل السريرية للمرشحين الرواية للقاحات المستندة إلى الحمض النووي في الحمار الوحشي البالغ. لا ننسى أن رفاهية الحيوانات مهم جدا، والتخدير السليم أمر ضروري أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

داء الليشمانيات الجلدي في الجلد الظهرية من الهامستر: نموذجا مفيدا لفحص المخدرات مضاد الليشمانيات

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

دراسة دور النسيج اللمفي البلعوم المرتبط (NALT) في الردود الفأر إلى اللقاحات

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D التصوير تعدد الوسائط من<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; التهابات في الفئران

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

طبيعي والخبيثة زرع العضلات خلية إلى المناعي للخطر اسماك الزرد الكبار

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...