Name: immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines
Uploaded: 2018-10-30T14:45:00
Duration: 5 min 39 s
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作者感谢实验免疫学研究组的成员, 特别是莉娜 Mäkinen 和 Hannaleena 卡里, 为他们在制定和优化疫苗接种方案方面所做的一切工作, 以及他们在实际实验中的帮助。使用协议。
这项工作得到了简 ja 阿托斯 Erkon Säätiö (简和阿托斯 Erkko 基金会; 磁共振成像技术), 西格丽德 Juséliuksen Säätiö (西格丽德 Juselius 基金会; 磁共振成像技术), 坦佩雷大学专家责任区竞争性国家研究经费筹措医院 (至磁共振成像技术), 坦佩雷 Tuberkuloosisäätiö (坦佩雷结核病基金会; 磁共振成像技术, 陛下, M.N.), 服务部 Kulttuurirahasto (芬兰文化基金会; 陛下), 服务部 Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen (芬兰抗结核基础陛下), Väinö ja 莱娜 Kiven säätiö (Väinö和莱娜凯威基金会; M.N.) 和坦佩雷城市科学基金会 (M.N.)。

包括成人斑马鱼在内的实验需要获得动物实验的许可, 以便进行疫苗接种以及随后的研究与感染模型。这里描述的所有方法和实验都是由芬兰动物实验委员会 (ESAVI) 批准的, 这些研究是按照欧盟指令 2010/63/欧盟进行的。
1. DNA 疫苗抗原的克隆
<ol><li>选择一种表达质粒, 用于在强、本构启动子 (如巨细胞病毒 (CMV) 立即启动剂) 下对所感兴趣抗原的真核表达进行优化。要在体内验证抗原表达, 请选择用于编码荧光标记的疫苗质粒, 例如本协议中使用的 pCMV-EGFP 质粒9 。</li>
	<li>使用适当的基于 web 和生物信息学的工具选择一个潜在的免疫保护抗原序列 (或多个序列) 约 90–600 nt (30–200 aa)26从病原体的基因的利益, 将用于在随后的感染模型。</li>
	<li>使用可用的软件, 或手动设计引物, 从病原体基因组中扩增抗原基因, 并将抗原序列克隆到表达质粒的多克隆部位。选择抗原时, 请务必保留正确的阅读框。</li>
	<li>在 5 ' 底漆中包括科扎克序列 (CCACC)27和起始密码子 (ATG)。要保留 C 终端 EGFP 标签, 请避免在抗原序列和 3 ' 底漆中介入停止密码子 (标记、TAA、TGA)。此外, 还要确保 GFP 标签与感兴趣的抗原保持在同一阅读框中。</li>
	<li>使用从病原体提取的 RNA 或 DNA 作为模板, 利用克隆引物生成足够数量的 PCR 产物。优选地, 使用校对 DNA 聚合酶保存正确的抗原序列。</li>
	<li>通过凝胶电泳纯化 PCR 产物并检查产品的正确尺寸。用消化疫苗质粒消化和结扎 PCR 产物。</li>
	<li>根据合适的协议将结扎混合物转化为合格的细菌细胞。对大肠杆菌中的阳性菌落和质粒生产使用适当的抗生素选择;例如, pCMV-EGFP 质粒含有氨苄青霉素耐药性基因。</li>
	<li>使用桑格测序确认正确抗原序列的插入。以下引物可用于 pCMV EGFP 质粒中的序列抗原: CMV 向前 5 '-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 ' 和 EGFP-N 反转 5 ' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3 '。</li>
	<li>生产和纯化足够数量的疫苗结构。在无菌水中溶解或洗脱质粒。确保所生产的质粒 DNA 质量高, 浓度至少为0.72 µM 或 2000 ng/µL。</li>
</ol>2. 拔出注射针头
<ol><li>提前准备注射针头。使用10厘米硅酸铝玻璃毛细管。请注意, 硼硅酸盐玻璃毛细血管太脆, 无法注射成年鱼。</li>
	<li>用微量吸管针制造的装置拉针头。 注: 针头应类似于图 1所示。使用本协议中的设备 (材料表), 以下设置将导致所需的针头类型:<ol>
<li>将玻璃毛细管放在拉拔杆的 V 形槽中, 轻轻拧紧夹紧旋钮。</li>
		<li>将支架移动到灯丝的旁边, 轻轻地将毛细管通过灯丝推入灯丝另一侧的拉拔器条。避免用毛细管接触灯丝。</li>
		<li>拧紧夹紧旋钮, 设置安全玻璃, 然后按下拉按钮。 注意: 灯丝是热的。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将针头放在一个15厘米培养皿板内可重复使用的粘合剂上, 以保护针头的尖端。把盘子盖好, 保持针头干净。</li>
</ol>3. 填充微量吸管针
<ol><li>准备疫苗组合。每剂量使用0.5–12µg 质粒。如果结合几种不同的质粒在一个疫苗组合, 使用最大总 DNA 浓度为12µg 每条鱼。</li>
	<li>根据每组鱼的数量计算疫苗 "主混合物" 的体积 (见下文)。添加1µl 无菌过滤酚红色到每个注射剂量, 以减轻毛细管针的灌装和注射的观察。添加无菌 1x PBS 高达最大总体积的µl 在一个注射剂量8。 注: 高于7µL 的注射量可能导致注射溶液偶尔渗漏, 因此应避免。</li>
	<li>将一块胶带、胶水侧上、适当的支架上, 例如, 一个空笔尖盒的一侧。轻轻地将毛细管针头连接到胶带上。</li>
	<li>将最多7µL 的疫苗混合在一张实验室胶片上。使用加载尖端, 将疫苗从胶片转移到针头中。缓慢而小心地吸管, 避免将气泡移入针头。</li>
	<li>让针头沉降15–30分钟, 去除可能残留的小气泡。</li>
</ol>4. 设置免疫显微注射仪和电转化仪
<ol><li>将微操作机器人和光源设置到正确的位置。将气压水龙头切换到打开的位置。</li>
	<li>调整气动泵的参数 (参见图 2), 如下所示。<ol>
<li>将弹出端口上的排气旋钮设置为保持, 以防止毛细管操作对移液器进行回填。将管道从弹出端口设置为微量吸管。请勿在本协议中使用真空端口。</li>
		<li>调整脉冲长度: 使用定时模式, 其中电子定时器控制压力螺线管保持打开状态的持续时间。检查在压力螺线管打开 (通电) 时, 弹出压力表旁边的绿色灯是否亮起。</li>
		<li>将脉冲范围设置为十年代;使用此设置, 脉冲可能会从 100 ms 进一步设置为10.1 秒. 使用10 转周期刻度盘微调脉冲长度-表盘的每一个转弯都是1.0 秒。如果需要, 也可以在注射过程中调整。</li>
		<li>使用气动泵前面板上的脉冲启动器 ("开始" 按钮) 或远程脚踏开关(推荐)。这是连接到气动泵的前面板。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将针头放在微操作机器人的微量吸管支架上。用镊子切割针头的尖端, 使液体可以被推出, 并使用显微镜查看正确的位置。按下脚踏开关一次, 看到1秒的脉冲从针头中推出一个小水滴。</li>
	<li>对电转化仪使用以下设置: 电压 = 40 V;脉冲长度 = 50 ms, 脉冲数 = 6。将镊子连接到电转化仪。请参阅显示器上显示的实际电压和脉冲长度与设置没有显著差异。</li>
</ol>5. 注射 DNA 疫苗和电穿孔
<ol><li>根据本协议的免疫接种, 使用健康, 6 到12月龄的成人斑马鱼。保持鱼在流经系统与14/10 小时光/暗循环, 最多七鱼每1升的水。</li>
	<li>准备一个 0.02% 3-苯甲酸酸乙酯 (tricaine) 溶液 (pH 7) 在水箱水麻醉鱼28。使用10厘米培养皿或类似的东西。</li>
	<li>用 3 l 的清洁系统水填充 5 l 烧杯, 准备回收箱。</li>
	<li>准备疫苗接种衬垫, 在疫苗接种期间保持鱼处于固定位置。取 5 x 7 厘米2片2至3厘米厚的海绵。用手术刀刀或锋利的剪刀将凹槽切成海绵。 注: 同一疫苗接种衬垫可用于多种实验。通过浸泡在70% 乙醇中并允许干燥, 在实验之间对海绵进行消毒。</li>
	<li>将海绵彻底浸泡在系统水中, 并将海绵放在培养皿上。</li>
	<li>在接种疫苗前24小时快速捕鱼。</li>
	<li>麻醉一只斑马鱼, 将其放置在含有 0.02% tricaine 的培养皿上。等到鱼不响应触摸刺激, 直到没有鳃的运动。一次麻醉一条鱼。</li>
	<li>使用塑料勺将麻醉斑马鱼转移到湿海绵上, 将鱼腹侧向下放置到凹槽中。在正确的位置, 确保鱼的头部和大部分的身体在凹槽内, 背鳍和尾巴从凹槽中凸出。</li>
	<li>在显微镜下, 使用微操作机器人上的 x 和 y 轴微调轮, 小心地将针头放在靠近斑马鱼背肌的近似45°角度。</li>
	<li>在背鳍前找到没有鳞片的小斑点, 在那里推针不需要用力。如果感觉到阻力, 请尝试相邻的点。避免伤害脊柱、背鳍或鳞片。 注: 如果针头在推压时弯曲, 则通过切割来略微缩短针头。</li>
	<li>使用脚踏开关逐渐将疫苗溶液注入肌肉。观察注射通过显微镜: 酚红色是可见的, 因为它进入肌肉组织。如果需要, 调整脉冲的持续时间。 注: 或者, 使用气动泵前面板上的脉冲启动器按钮进行注射。然而, 使用远程脚踏开关允许使用另一只手调整脉冲长度由10转拨号轮。避免注射溶液太快, 因为这可能会导致过度的组织损伤。确保不要注射任何空气。</li>
	<li>注射后立即电击鱼。确保鱼还在麻醉下。将鱼放在海绵上, 将鱼放在镊子型电极之间, 使电极位于注射部位的两侧。不要按压电极镊子太紧, 但保持两个电极接触鱼。<ol>
<li>按电转化仪上的 "开始" 按钮可提供六 40 V、50 ms 脉冲。</li>
		<li>将鱼轻轻地转移到回收池。</li>
		<li>每次电穿孔后, 通过轻扫70% 乙醇, 清洁电极。 注意: 在接种疫苗后仔细监测鱼的福祉。安乐死任何鱼显示出不适的迹象 (从麻醉缓慢恢复, 异常游泳, 气喘吁吁) 在 0.04% tricaine。恢复后, 将鱼转移到流经单位并正常喂饲。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 抗原表达的可视化和成像
<ol><li>在免疫后的 0.02% tricaine 2–7天麻醉鱼, 并使用紫外光观察注射部位附近的 EGFP 表达。 注意: 紫外线照射下的目视检查是一种易于和非侵入性的手术, 适合于对成功接种疫苗进行例行验证, 也适用于大规模实验。如果不需要鱼的图像, 这一步也可以在常规鱼缸中执行, 而无需麻醉或移动鱼。</li>
	<li>要捕获图像, 请使用荧光显微镜在注射部位8显示 EGFP 表达式。使用2X 物镜并选择正确的滤镜以可视化荧光或可见光视图。</li>
	<li>保持麻醉鱼仍然通过按压腹鳍轻轻地用镊子向培养皿底部。同时拍摄同一区域的光显微镜和荧光图像。</li>
	<li>使用相应的软件29合并光显微镜和荧光图像。添加比例栏。</li>
</ol>7. 量化抗原的表达水平和大小
<ol><li>安乐死鱼在 0.04% tricaine。用手术刀和镊子在紫外光下解剖背肌的荧光部分。从样品中提取蛋白质8。</li>
	<li>使用一个辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭 GFP 抗体 (或类似)8验证在体内生产的蛋白质的正确大小与西方印迹分析。包括一个负控制 (接种鱼), 以排除任何背景信号和非特异性绑定, 以及表示 EGFP 没有融合抗原的控制。 注: 对于西方印迹分析, 可以计算抗原融合蛋白的预期大小 (kDa), 例如, 公式: dsDNA 的分子量 (MW) = (核苷酸数 x 607.4) + 157.9;或使用基于 web 的工具。</li>
	<li>使用 GFP-ELISA8 (可选) 量化每个抗原的表达。</li>
</ol>8. 将疫苗接种方案与m. 杆菌感染模型相结合
<ol><li>确定在感染模型和使用的试验中可靠确定新疫苗候选的有效性所需的组大小 (参见, 例如, 米吕迈基et al.24和查兰和 Kantharia30)。在计划实验时进行适当的功率计算。</li>
	<li>为了评估疫苗候选者的有效性, 5 周 postimmunization 感染鱼类。使用腹腔感染与大约30个菌落形成单位 (cfu) 的m 杆菌, 导致潜伏感染在大多数鱼8,20,31。 注意: 使用m 杆菌时, 请遵循 BSL2 安全协议。细菌或病毒的制备取决于病原体。</li>
	<li>量化每条鱼的病原体数量。安乐死鱼4周感染后, 并确定每条鱼的细菌负担从提取的 DNA 与 qPCR 使用特定于m 杆菌20,24的引物。 注意: 请务必包含适当的控制组, 并使用正确的统计方法分析结果。一般而言, 用空 pCMV EGFP 质粒免疫的一组鱼是一种合适的阴性对照。</li>
	<li>使用无 GFP 标记的抗原确认阳性结果。如步骤1所述克隆抗原, 并重复接种实验。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

以 DNA 为基础的疫苗对成人斑马鱼进行免疫的过程需要一些技术专长。即使是有经验的研究员, 接种一条鱼大约需要3分钟, 不包括制剂。因此, 在一天内最多可以接种大约100条鱼。如果实验需要超过100条鱼, 则免疫接种可分为3天。除了实验的质量外, 研究人员对鱼类的处理和免疫接种的充分训练对鱼类的福祉至关重要。确保遵守当地的法律和动物福利规则和指导方针, 当涉及到住房的鱼, 计划的实验, 以及所需的人员进行实验的资格。
总之, 有几个关键步骤, 以避免在免疫协议的复杂化。为成功进行免疫接种, 确保1)要接种的鱼在年龄和大小上都是健康和充足的 (对更多的幼鱼进行免疫可以要求降低疫苗体积和电穿孔设置);2)鱼是正确的麻醉, 没有强于 0.02% 3-苯甲酸酸乙酯, 他们仍然麻醉整个过程中 (麻醉应保持尽可能短, 以确保鱼的恢复);3)海绵垫适当浸泡;4)液体从气动泵中注入每个脉冲, 如果没有, 脉冲长度调整 (沿 y 轴稍微向后拉针可以帮助);5)疫苗解决方案没有气泡;6)电穿孔设置和实际脉冲电压和长度正确;7)电极不会对电穿孔部位造成皮肤损伤 (在电击过程中, 保持电极与鱼的轻柔接触, 并在电穿孔后立即将鱼放进回收池)。
重要的是要监测的鱼后, 在回收池中的电穿孔和安乐死任何迹象显示不舒服的鱼。此外, 在进行大规模实验之前, 必须先练习程序, 以确保流畅的工作流程。如果可能的话, 请一个训练有素的同事来帮助填补针头和电穿孔。
DNA 疫苗接种方法可为疫苗抗原量身定制设计。可以克隆整个抗原或, 优选地, 根据细胞定位和免疫原性24选择抗原的部分。此外, 该方法可以将几个抗原或佐剂组合成一个疫苗结构, 或在同一时间2注射几个单独的质粒。通过在抗原序列后包括一个停止密码子或通过切除从质粒的 EGFP 基因, 它可以利用相同的质粒载体也表达抗原没有随后的 n-末端 GFP 标记。这可能是合理的确认阳性筛查结果, 因为相对较大的 GFP 可能影响抗原的折叠, 从而限制体液反应可能诱发的疫苗接种。
更高的抗原表达已链接到 DNA 疫苗免疫原性2。注射后的电穿孔, 因此, 被列入本议定书, 因为它已被证明增加抗原或报告基因的表达在斑马鱼32。此外, 电穿孔作为一种技术导致中等组织损伤, 从而诱发局部炎症进一步促进疫苗诱发免疫反应2。另一方面, 电穿孔一般耐受性好。在这里使用的设备, 几乎100% 的成人斑马鱼将恢复良好的六脉冲 40 V 使用在本协议35。
除了使用电穿孔提高疫苗质粒进入细胞, 我们使用一个强大无处不在的启动子在疫苗质粒和波利亚尾巴在 3 ' 末端的抗原, 以改善在转染的鱼细胞的抗原表达。在某些情况下, 如果目标病原体的密码子使用与接种的物种有显著差异, 密码子优化在进一步增加目标基因表达2中是有用的。然而, 在这条斑马鱼m. 杆菌模型中, 密码子优化对两个分枝杆菌模型基因、 ESAT-6和CFP-10的表达水平没有显著影响, 因此在这个模型中被认为是不必要的35.
靶基因表达谱在抗原之间有一定的时间变化, 具体取决于抗原的大小和结构。然而, 抗原表达通常是相似的在一组鱼类接种同一疫苗。通常, 最亮的 EGFP 表达式被观察四天到一周 postvaccination, 但2–10天的规模是可能的。建议在一小群鱼 (EGFP) 中验证每个抗原-------------的融合蛋白的表达, 然后在大规模实验中包括抗原。如果在免疫后的2–10天内没有观察到 GFP 的表达, 请确保1)免疫接种协议被仔细地遵循。始终有一组以空 pCMV EGFP 质粒为阳性对照的鱼类, 并确保2)抗原设计和分子克隆正确进行 (充分的底漆设计; 抗原和 EGFP 标记都在同一读取帧和没有干预停止密码子包括在内)。在某些情况下, 尽管正确的抗原设计, GFP 无法检测到。这可能是由于不正确的折叠或快速分解的融合蛋白。在这种情况下, 可能有必要重新设计抗原。
在用于免疫养殖鱼类的疫苗中, 使用的质粒剂量通常为1µg 或小于7、33、34。在斑马鱼中, 通过电穿孔后至少0.5 µg 质粒注射液也能检测到报告基因的表达;然而, 相对靶基因表达显著增加, 每条鱼的质粒量 (补充图 1)。在用 pCMV-EGFP 报告质粒注射的鱼中, 与注射 0.5 EGFP 的鱼相比, 与5–20µg 的质粒的注射导致的µg 水平高出四至八倍。因此, 为了确保足够高的靶基因表达, 还有足够小的注射量 (≤7µL), 以防止任何过量的组织损伤或疫苗泄漏, 我们选择使用5到12µg 每条鱼为初步筛选目的。除了疫苗免疫原性外, 还需要一个足够高的靶基因表达, 用荧光显微镜和西方印迹检测报告基因的表达, 这对于筛查目的以确认体内是否正确是必要的。目标抗原的翻译。然而, 低质粒剂量 (0.5–1µg) 可用于其他类型的实验用途。
最后, 本议定书的免疫的成人斑马鱼与 DNA 质粒可用于新疫苗候选的临床前测试针对各种细菌或病毒感染。疫苗抗原作为 GFP 融合蛋白的表达允许成功的免疫事件和抗原表达的可视化。我们将此方法应用于新型疫苗抗原候选抗结核的临床前筛选。为此, 我们感染斑马鱼五周 postvaccination, 并确定每条鱼的细菌计数20,24。

第一个 dna 疫苗研究是在二十世纪九十年代1进行的, 从那时起, dna 疫苗已经针对各种传染性疾病、癌症、自身免疫和过敏2进行了测试。在哺乳动物中, 一种针对马西尼罗病毒的 DNA 疫苗和用于犬口服黑色素瘤的治疗性癌症疫苗已获得许可, 但目前尚未在临床上使用2。除了哺乳动物研究引起的兴趣外, DNA 疫苗接种已成为一种方便的方法来免疫养殖鱼类抵御病毒性疾病。自2005年以来, 一项针对鱼类传染性造血坏死病毒 (IHNV) 的疫苗已在商业上使用, 而一项针对传染性胰腺坏死病毒 (IPNV) 的疫苗最近获得了3的许可。此外, 还在开发一些针对鱼类病原体的 DNA 疫苗。
由于传统疫苗通常含有灭活或活性减弱的病原体, 因此它们会造成2传染疾病的潜在风险。DNA 疫苗反过来也可以避免这种风险, 因为它们是基于对细菌或病毒抗原进行质粒编码的管理, 而不是整个病原体本身2,4。dna 疫苗是用 dna 重组技术生产的, 这使得疫苗抗原的精确设计和抗原组合和佐剂在单一疫苗结构中的灵活配方5。此外, DNA 疫苗的生产比基于蛋白质的重组疫苗更快、更容易和更具成本效益, 这是疫苗候选筛查的主要优势, 而且, 例如, 在大流行性暴发的情况下2。
在鱼类中, DNA 疫苗最常见的管理途径是腹腔、肌肉和口服3、6、7, 而在哺乳动物中, 皮下和皮内路是额外的选项2。在肌肉注射后, 所管 DNA 质粒进入管理部位 (g., 主要是肌细胞, 但也驻留抗原呈现细胞 [apc]) 中的单元格。电穿孔2、8可显著提高转染细胞的比例。进入细胞后, 一些质粒 DNA 进入细胞核, 其中由质粒编码的基因转录2。在本协议中, 我们利用 pCMV-EGFP 质粒, 它具有强大的无处不在的启动子, 针对真核表达式9进行优化。在这个结构中, 抗原被翻译成融合蛋白与 GFP。GFP 通过荧光显微镜在活鱼中简单地显示抗原表达, 从而确认成功的疫苗接种和正确的抗原产物。
在哺乳动物中, DNA 疫苗被证明可以刺激不同类型的免疫反应, 具体取决于转染的细胞类型2,5。转染的肌细胞将抗原分泌到细胞外空间或释放它们, 然后被 apc 吞噬的抗原随后呈现在主要的相容复合物 II 分子2上。这会触发 CD4 和 CD8 T 细胞响应, 尤其是 B 细胞响应2、5、10。在鱼, T 和 B 淋巴细胞, 以及树突状细胞 (DCs), 已经确定, 但他们的分工在抗原演示中不太清楚11。然而, 斑马鱼 DCs 已被证明与他们的哺乳动物同行分享保守的表型和功能特征12。此外, DNA 疫苗接种已被证明可以在鱼类和哺乳动物中引起类似的免疫反应, 包括 T 和 B 细胞反应6、13、14、15、16.
幼虫和成年斑马鱼都被广泛用于模拟不同的传染病, 如本议定书17、18、19、20 条所用结核杆菌感染模型. ,21,22。与哺乳动物模型生物相比, 斑马鱼的优势包括小尺寸、快速重现性和低住房费用23。这些方面使斑马鱼成为新疫苗和药物化合物的大型临床前筛选研究的理想动物模型23,24,25。
在本协议中, 我们描述了如何利用成人斑马鱼的 DNA 疫苗来评估新的疫苗抗原候选杆菌。首先, 我们描述了抗原是如何被克隆到 pCMV-EGFP 表达质粒中的, 然后是一个详细的协议, 用于肌肉注射疫苗粒度和随后的电穿孔成肌。每抗原的表达通过荧光显微镜证实, 一周 postimmunization。抗原候选的有效性, 然后测试通过实验感染接种的鱼与m. 杆菌。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pCMV-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475-2L</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02445.2500</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Pulling of needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet PCR Purification kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP ELISA kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td>AKR-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate (FW 118.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>imagej.net/Downloads</td>
			<td></td>
			<td>freely available software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MA-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AZ100</td>
			<td>fluorescense microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ZS61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>E404-200TABL.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114537-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV830 Phneumatic Pico Pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>ID:12163</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (FW294.1)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27833.294</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Inc.</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040-100g</td>
			<td>anestesia and euthanasia solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base) (FW121.14)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX 450165</td>
			<td>tweezer type electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mmCeramic beads</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646-3</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Tough tubes with caps</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-649</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate capillaries</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 20 &#181;l</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 16 mm</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swan Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td>laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam workbench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines

在过去的两年中, 对基于 DNA 的疫苗接种的兴趣有所增加。DNA 疫苗接种的基础是克隆选定抗原的序列或将抗原组合成质粒, 从而实现量身定做和安全的设计。DNA 疫苗在宿主细胞中的管理导致抗原的表达, 刺激体液和细胞介导的免疫反应。本报告描述了将抗原序列克隆到 pCMV-EGFP 质粒中的一种协议, 通过肌内显微注射将成人斑马鱼与疫苗候选者进行免疫, 以及随后的电穿孔以改善摄入量。疫苗抗原被表示为绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白, 它允许确认在紫外光下的抗原表达在活鱼和定量的表达水平的融合蛋白与 ELISA, 以及他们的检测与西方印迹分析。疫苗候选者的保护作用通过感染鱼与分枝杆菌杆菌五周 postvaccination, 其次是定量的细菌与四周后的 qPCR。与哺乳动物临床前筛选模型相比, 该方法为新的基于 DNA 的疫苗候选分枝杆菌感染的初步筛选提供了一种经济有效的方法。该方法可进一步用于筛选基于 DNA 的疫苗, 针对各种细菌和病毒性疾病。

如图 3所示, 成人斑马鱼的 DNA 疫苗接种协议所涉及的步骤。首先, 选定的抗原序列被克隆成 pCMV-EGFP 质粒, 质粒 DNA 生成并纯化24 (图 3)。疫苗候选者然后注射肌肉注射与显微注射仪和注射部位是转提高质粒进入细胞的摄入量 (图 3)。通过注射不同数量的 pCMV EGFP 质粒, 用 ELISA 法测定 GFP 表达, 对使用的疫苗接种剂量进行了优化 (补充图 1)。七天 postvaccination, 在紫外光下检测融合蛋白的表达, 并通过荧光显微镜进行可视化 (图 3和图 4)。不同抗原的表达水平可能从非常密集 (抗原 1) 到微弱的表达式 (图 4) 不同。此外, GFP 表达可以跨背肌观察 (抗原 1), 或在一个更有限的区域 (抗原 2) (图 4)。但是, 如果在10天内未检测到荧光, 建议确保在抗原克隆或底漆设计中没有错误。为了确认所表达的融合蛋白的大小正确, 可以从注射部位周围的肌肉组织中提取蛋白质, 并用于西方印迹分析。
通过腹腔注射 (图 5) 对低剂量m 杆菌的鱼进行挑战, 评估疫苗候选者的效果。四至五周感染后, 细菌计数用 qPCR 测定, 并与对照组的细菌负荷进行比较 (图 5)。此外, 最有希望的疫苗候选的有效性可以通过监测在高剂量m. 杆菌感染后的存活(图 5) 进行测试。然而, 除了给感染的进展提供定量的结果, 而不是仅仅是活着或死的状态, 基于 qPCR 的 cfu 量化需要更少的时间和较小的组大小, 因此, 一个更合乎道德的方法为初级屏幕。总的来说, 该议定书有助于在12周内筛选新疫苗抗原的有效性 (图 5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig1.jpg"> 图 1: 在成人斑马鱼肌内注射中使用的硅酸铝针的特写 (12X).下面的笔尖已被切割用镊子, 准备用于 microinjections。这个数字是从 Oksanen35改编的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig2.jpg"> 图 2: 显微注射设备和设置.成人斑马鱼的 DNA 疫苗接种所需设备的主要成分以粗体突出显示。将显示关键调整。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig3.jpg"> 图 3: 制备 DNA 疫苗质粒和免疫程序.(1) 所选抗原在 pCMV-EGFP 质粒中与 GFP 标记相邻克隆。(2) 疫苗构造微生物、浓缩、纯化。(3) 12 µg 质粒被注射到麻醉成人斑马鱼的背肌中, 显微注射仪, 注射部位随后转六 40 V、50 ms 脉冲。(4) 两至七天 postvaccination, 用荧光显微镜对抗原 gfp 融合蛋白的 gfp 表达进行了可视化处理。(5) 背肌荧光部分可进行解剖, 用于蛋白质提取。融合蛋白的大小得到了西方印迹分析和 GFP-ELISA 的表达水平的确认。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2.jpg"> 图 4: 可视化抗原-EGFP 融合蛋白的表达.麻醉成人斑马鱼接种12µg 实验疫苗抗原 (抗原), 注射部位为转, 随后为六 40 V, 50 ms 脉冲。七天 postvaccination, 注射部位用显微镜成像。首先, 荧光显微镜下检测 GFP 的表达。该区域使用2X 震级目标进行检查, 并以. tiff 形式进行成像和保存。使用 ImageJ 软件将同一区域的光镜图像与荧光图像合并。抗原表达的数量和位置在抗原和个别鱼之间可能有所不同。例如, 在背肌中观察到抗原1的表达, 抗原2的表达被视为小斑点, 而抗原3则在更有限的区域中得到强烈表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig5.jpg"> 图 5: 测试疫苗候选者对分枝杆菌感染的有效性.(1) 成人斑马鱼接种杆菌实验 DNA 疫苗。(2) 五周 postvaccination, 鱼被感染了低剂量的分枝杆菌杆菌(约 30 cfu)。(3) 四周后, 内脏被解剖并用于 DNA 提取。(4) 每条鱼中的细菌计数使用m 杆菌特异性引物进行定量。免疫与抗原1导致显著减少细菌计数 (p < 0.01, 双向方差分析), 而抗原2和3没有影响。(5) 最有希望的疫苗候选者 (抗原 1) 的保护作用在生存试验中进一步评估, 其中鱼类感染了细菌的高剂量 (约 1万 cfu), 其存活时间为12周。与面板4中观察到的细菌负担减少一致, 抗原1疫苗接种也改善了杆菌感染 (p < 0.01) 的鱼的存活, 这表明这种抗原可能是一个有前途的新的结核病疫苗候选者。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/58453/58453figS1.jpg"> 补充图 1: 质粒 DNA 量对成人斑马鱼质粒衍生 EGFP 表达的影响.组鱼 (n = 5 在每个组) 注射与0.5–20微克的 pCMV-EGFP, 和电穿孔 (六脉冲 50 V) 用于增强转染。对照鱼 (CTRL) 注射2微克的空 pCMV 质粒不含 EGFP 基因。GFP-ELISA 被执行3天注射后定义在鱼匀浆的相对 EGFP 表达。p 值: *p < 0.03, ***p < 0.004。误差线表示标准偏差。NS = 不显著。这个数字是从 Oksanen35改编的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453figS1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>

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Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

成人斑马鱼对 DNA 疫苗临床前筛选的免疫研究

在这里, 我们描述了一项关于成人斑马鱼 (斑马斑马) 免疫接种的协议, 以 DNA 为基础的疫苗, 并证明了成功的疫苗接种事件的验证。该方法适用于各种感染模型的疫苗候选者的临床前筛选。

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

我们使用这个协议来寻找新的结核病候选疫苗，但我可以应用于其他传染病。与哺乳动物模型相比，该方法为新型DNA疫苗候选者的初步筛选提供了一种具有成本效益的程序。演示这个程序的将是汉纳莱娜·皮普波，一个来自我们实验室的技术人员。首先，将玻璃毛细管安装到极性杆中的 V 形槽中，轻轻拧紧夹紧旋钮。将支架移至灯丝旁边，轻轻将毛细管推过灯丝，进入灯丝另一侧的极坐标杆。接下来，拧紧夹紧旋钮，放下安全玻璃，然后按下拉紧按钮。在此之后，将针头放在培养皿内的可重复使用的粘合剂上，以保护针头尖。首先，使用每剂量0.5至12微克质粒准备注射混合物。为组中的鱼数准备适当的主混合量。将毛细管针放在适当支架上的胶带粘性侧。接下来，将质粒剂量的移液滴滴滴到一块实验室薄膜上。在此之后，使用加载尖端将质粒滴从薄膜转移到针头中。缓慢而小心地移液，避免将气泡移入针头。放置微型操纵器和光源。然后将气压水龙头切换到打开位置。在微型喷油器前面板上，使用分时模式将脉冲长度调整为 10 秒。然后，使用 10 圈周期表盘微调脉冲长度。接下来，将针头放在微型操纵器的微移液器支架上。使用钳子切割针头，让液体被推出，并使用显微镜评估针头的位置。按一次远程脚部开关，验证一秒脉冲是否将小液滴从针头中推出。然后调整电穿孔器设置，将钳子连接到电穿孔器。为了在注射过程中使鱼处于固定位置，请使用一块海绵，中间有凹槽，作为衬垫。将海绵彻底浸泡在系统水中，并放在培养皿中。使用塑料勺将麻醉斑马鱼转移到湿海绵中，鱼的腹侧在凹槽中向下。在显微镜下，将针头以45度角靠近斑马鱼的背部肌肉，然后在背鳍前找到没有鳞片的小点，将针头推入肌肉。如果感觉到任何阻力，请尝试相邻点。使用脚部开关逐渐将质粒溶液注射到肌肉中。在显微镜下，苯酚红色应可见，因为它进入肌肉组织。注射后，将钳子式电极放在注射部位的每一侧，立即对鱼进行电化。按下电穿孔器上的启动按钮，并给它六个 40 伏 50 毫秒脉冲。然后，轻轻地将鱼转移到回收罐。最后，根据文本协议对鱼进行一次分析后，使用紫外光在注射部位附近看到EGFP表达式。在此协议中，DNA抗原在表达载体中与GP相邻被克隆。斑马鱼在肌肉内用微注射器注射DNA抗原质粒，注射部位进行电位化，以改善质粒进入细胞的摄入量。对于成像，抗原表达可以通过荧光显微镜进行可视化。在这种情况下，在注射部位附近检测到所有三种抗原GP融合蛋白的表达，尽管其强度不同。斑马鱼在接种分枝杆菌抗原五周后感染了马琳分枝杆菌。QPCR用于确定每条鱼在感染后四周的细菌负担。与对照组相比，使用抗原一剂免疫的鱼在感染M.marinum后细菌负荷减少。在执行该方法时，在大规模实验前对质粒结构进行精心设计，验证抗原的表达，并实践注射技术十分重要。这项技术可以为成人斑马鱼中新型基于DNA的疫苗候选者进行具有成本效益的临床前筛查铺平道路。不要忘记，动物的福利是非常重要的，适当的麻醉是必不可少的，而执行这个程序。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

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Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

科研

免疫与感染

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

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