Name: immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines
Uploaded: 2018-10-30T14:45:00
Duration: 5 min 39 s
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लेखक प्रयोगात्मक इम्यूनोलॉजी अनुसंधान समूह के सदस्यों के लिए आभारी हैं, और विशेष रूप से लीना Mäkinen और Hannaleena Piippo के लिए, सभी काम के लिए वे विकास और टीकाकरण प्रोटोकॉल के अनुकूलन में किया है, और वास्तविक प्रयोगों में उनकी मदद प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।
यह काम जेन ja Aatos Erkon Säätiö (जेन और Aatos Erkko फाउंडेशन; टू यूननट), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius foundation; टू यूननट), हेरा फेरी विश्वविद्यालय के विशेषज्ञ उत्तरदायित्व क्षेत्र के प्रतियोगी राज्य अनुसंधान वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया अस् पताल (to यूननट), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (हेरा क्षयरोग फाउंडेशन; to यूननट, H.M., और M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (फिनिश सांस्कृतिक फाउण्डेशन; to H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (फ़िनिश एंटी तपेदिक फाउंडेशन ते H.M.), Väinö ja लािना Kiven säätiö (Väinö and लािना Kivi foundation; to M.N.) और हेरा फेरी सिटी साइंस फाउंडेशन (to M.N.).

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

डीएनए के साथ immunizing वयस्क zebrafish की प्रक्रिया टीकों आधारित कुछ तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है । यहां तक कि एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए, टीका लगाने एक मछली लगभग 3 मिनट लेता है, तैयारियों को छोड़कर । इस प्रकार, लगभग १०० मछली की एक अधिकतम एक दिन के भीतर प्रतिरक्षित जा सकता है । यदि प्रयोग के लिए १०० से अधिक मछलियों की आवश्यकता होती है तो प्रतिरक्षण को 3 दिनों के बीच विभाजित किया जा सकता है. प्रयोग की गुणवत्ता के अलावा, मछली से निपटने के लिए शोधकर्ता (ओं) की पर्याप्त प्रशिक्षण और प्रतिरक्षण प्रदर्शन मछलियों की भलाई के लिए आवश्यक है । स्थानीय कानूनी और पशु कल्याण नियमों और दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें कि जब यह मछली आवास की बात आती है, प्रयोगों की योजना बना, और प्रयोगों बाहर ले जाने वाले कर्मियों के लिए आवश्यक योग्यता.
संक्षेप में, प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल में जटिलताओं से बचने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सफल प्रतिरक्षण के लिए, यह सुनिश्चित करें कि 1) मछली प्रतिरक्षित होने के लिए स्वस्थ और आयु और आकार में पर्याप्त है (अधिक किशोर मछली के प्रतिरक्षण नीचे की आवश्यकता कर सकते है वैक्सीन मात्रा स्केलिंग और electroporation सेटिंग्स); 2) मछली ठीक से कोई मजबूत ०.०२% 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर के साथ anesthetized हैं, और वे पूरे प्रक्रिया के दौरान anesthetized रहना (संज्ञाहरण के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए मछली की वसूली सुनिश्चित करने के लिए); 3) स्पंज पैड ठीक से लथपथ है; 4) तरल वायवीय पंप से प्रत्येक पल्स में इंजेक्शन है और, अगर नहीं, नाड़ी लंबाई (y-अक्ष मदद कर सकते हैं के साथ थोड़ा पीछे सुई खींच) समायोजित किया जाता है; 5) वैक्सीन समाधान के साथ कोई हवाई बुलबुले हैं; 6) electroporation सेटिंग्स और वास्तविक पल्स वोल्टेज और लंबाई सही हैं; 7) इलेक्ट्रोड electroporation साइट पर त्वचा के नुकसान का कारण नहीं है (electroporation के दौरान, मछली के साथ कोमल संपर्क में इलेक्ट्रोड रखने के लिए, और electroporation के बाद वसूली टैंक में तुरंत मछली रिलीज).
यह वसूली टैंक में electroporation के बाद मछली पर नजर रखने के लिए और असुविधा के लक्षण दिखाने के लिए किसी भी मछली euthanize करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह एक बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले प्रक्रिया का अभ्यास करने के लिए आवश्यक है, एक धाराप्रवाह कार्यप्रवाह सुनिश्चित करने के लिए । यदि संभव हो, सुई और electroporation भरने के साथ सहायता के लिए एक पर्याप्त प्रशिक्षित सहकर्मी से पूछो ।
डीएनए टीकाकरण विधि वैक्सीन एंटीजन की दर्जी निर्मित डिजाइन को सक्षम बनाती है । यह पूरे प्रतिजन क्लोन करने के लिए संभव है या, अधिमानतः, का चयन करें antigen के भागों सेलुलर स्थानीयकरण और immunogenicity24पर आधारित है । इसके अलावा, इस विधि में कई एंटीजन या adjuvants एक टीके का निर्माण या एक ही समय में कई अलग plasmids इंजेक्शन के संयोजन में सक्षम बनाता है2. द्वारा एक बंद codon antigen अनुक्रम के बाद या EGFP जीन प्लाज्मिड से एक्साइज द्वारा सहित, यह भी एक ही प्लाज्मिड वेक्टर का उपयोग करने के लिए संभव है के बाद एन टर्मिनल GFP टैग के बिना प्रतिजन व्यक्त करते हैं । यह सकारात्मक स्क्रीनिंग परिणामों की पुष्टि करने में उचित हो सकता है, GFP के अपेक्षाकृत बड़े आकार के रूप में प्रतिजन की तह को प्रभावित कर सकते हैं और, इस प्रकार, संभावित टीकाकरण द्वारा पैदा की विनोदी प्रतिक्रियाओं को प्रतिबंधित.
एक उच्च प्रतिजन अभिव्यक्ति डीएनए वैक्सीन immunogenicity2से जोड़ा गया है । Electroporation के बाद इंजेक्शन है, इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है, के रूप में यह प्रतिजनों या रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है चौगुना से दस गुना करने के लिए zebrafish३२में । इसके अलावा, एक तकनीक के रूप में electroporation उदारवादी ऊतक चोट का कारण बनता है, इस प्रकार स्थानीय सूजन उत्प्रेरण कि आगे टीका प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं2। दूसरी ओर, electroporation आम तौर पर अच्छी तरह से सहन कर रहा है । उपकरणों के साथ यहां इस्तेमाल किया, व्यावहारिक रूप से वयस्क zebrafish के १००% ४० इस प्रोटोकॉल३५में इस्तेमाल की छह दालों से अच्छी तरह से ठीक हो जाएगा ।
कोशिकाओं में वैक्सीन प्लाज्मिड के प्रवेश को बढ़ाने के लिए electroporation का उपयोग करने के अलावा, हम transfected मछली कोशिकाओं में प्रतिजन अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए प्रतिजन के 3 ' अंत में एक मजबूत सर्वव्यापी प्रमोटर वैक्सीन प्लाज्मिड में और एक polyA पूंछ का उपयोग करें । कुछ मामलों में, अगर लक्ष्य रोगज़नक़ के codon उपयोग काफी टीका लगा प्रजातियों से अलग है, codon अनुकूलन आगे बढ़ाने लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति2में उपयोगी पाया गया है । इस zebrafish-M. marinum मॉडल में, हालांकि, codon अनुकूलन दो माइक्रोबैक्टीरियल मॉडल जीन, ESAT-6 और -10 के अभिव्यक्ति स्तर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था, और इस प्रकार है, इस मॉडल में अनावश्यक समझा गया है३५ .
लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल एंटीजन के बीच कुछ लौकिक भिन्नता, उदाहरण के लिए, आकार पर और समस्याग्रस्त एंटीजन की संरचना पर निर्भर करता है । हालांकि, antigen अभिव्यक्ति एक ही वैक्सीन के साथ मछली प्रतिरक्षित के एक समूह के भीतर आमतौर पर समान है । आमतौर पर, प्रतिभाशाली EGFP अभिव्यक्ति चार दिनों के एक सप्ताह postvaccination के लिए मनाया जाता है, लेकिन 2 के पैमाने-10 दिन संभव है । यह एक बड़े पैमाने पर प्रयोग में प्रतिजन सहित पहले मछली (2 – 3) के एक छोटे समूह में प्रत्येक प्रतिजन-EGFP फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए सिफारिश की है । यदि कोई GFP अभिव्यक्ति किसी भी बिंदु पर मनाया जाता है 2 – 10 दिनों के बाद प्रतिरक्षण, सुनिश्चित करें कि 1) प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल सावधानी से पीछा किया गया था. हमेशा एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में खाली pCMV-EGFP प्लाज्मिड के साथ मछली प्रतिरक्षित के एक समूह है और सुनिश्चित करें कि 2) प्रतिजन डिजाइन और आणविक क्लोनिंग सही ढंग से किया गया था (पर्याप्त प्राइमर डिजाइन; प्रतिजन और EGFP टैग एक ही में दोनों कर रहे हैं पढ़ना फ्रेम और कोई हस्तक्षेप रोक codons शामिल हैं) । कुछ मामलों में, सही antigen डिज़ाइन के बावजूद GFP का पता नहीं लगाया जा सकता । यह फ्यूजन प्रोटीन की गलत तह या तेजी से टूटने के कारण हो सकता है । इन परिस्थितियों में antigen को पुन: डिज़ाइन करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
टीके में है कि farmed मछली छुटकारा के लिए उपयोग किया जाता है, प्लाज्मिड खुराक का इस्तेमाल किया आम तौर पर 1 µ जी या कम7,३३,३४है । zebrafish में रिपोर्टर जीन एक्सप्रेशन के बाद भी पता लगाया जा सकता है कि कम से कम एक ०.५ µ जी प्लाज्मिड इंजेक्शन निम्न electroporation; हालांकि, सापेक्ष लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति काफी प्लाज्मिड प्रति मछली (अनुपूरक आंकड़ा 1) की एक उच्च राशि के साथ बढ़ जाती है । मछली में pCMV के साथ इंजेक्शन-EGFP रिपोर्टर प्लाज्मिड, 5 के साथ एक इंजेक्शन-20 µ जी प्लाज्मिड के परिणामस्वरूप मछली के साथ तुलना में चार से आठ बार उच्च EGFP स्तर ०.५ µ जी के साथ इंजेक्शन इसलिए, एक उच्च पर्याप्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, अभी तक इंजेक्शन मात्रा है कि काफी छोटे हैं (≤ 7 µ एल) किसी भी अतिरिक्त ऊतक क्षति या वैक्सीन रिसाव को रोकने के लिए, हम प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए मछली प्रति 5 से 12 µ जी का उपयोग करने के लिए चुना है । वैक्सीन immunogenicity, एक उच्च पर्याप्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के अलावा एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ और पश्चिमी दाग है, जो स्क्रीनिंग के प्रयोजनों के लिए आवश्यक है vivo में सही पुष्टि के साथ रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक है लक्ष्य antigen का अनुवाद । हालांकि, कम प्लाज्मिड खुराक (0.5-1 µ g) अन्य प्रकार के प्रायोगिक उपयोगों के लिए उपयोगी हो सकते हैं ।
अंत में, एक डीएनए प्लाज्मिड के साथ वयस्क zebrafish के प्रतिरक्षण के लिए इस प्रोटोकॉल उपंयास वैक्सीन उंमीदवारों के विभिंन जीवाणु या वायरल संक्रमण के खिलाफ नैदानिक परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक GFP-फ्यूजन प्रोटीन के रूप में टीका प्रतिजन की अभिव्यक्ति एक सफल प्रतिरक्षण घटना और प्रतिजन अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है । हम तपेदिक के खिलाफ उपंयास वैक्सीन प्रतिजन उंमीदवारों की नैदानिक जांच के लिए इस विधि लागू होते हैं । इस के लिए, हम zebrafish पांच सप्ताह postvaccination संक्रमित और qPCR20,24के साथ प्रत्येक मछली में जीवाणु गिनती निर्धारित करते हैं ।

पहले डीएनए वैक्सीन अध्ययन 1990 के दशक में प्रदर्शन कियागया था, और तब से, डीएनए टीके विभिंन संक्रामक रोगों, कैंसर, प्रतिरक्षा, और एलर्जी2के खिलाफ परीक्षण किया गया है । स्तनधारी, घोड़ों में पश्चिम नील नदी वायरस और कुत्ते मौखिक मेलेनोमा के लिए एक चिकित्सीय कैंसर वैक्सीन के खिलाफ एक डीएनए टीका लाइसेंस प्राप्त किया गया है, लेकिन इन नैदानिक उपयोग2में वर्तमान में नहीं कर रहे हैं । स्तनधारी अध्ययन द्वारा पैदा ब्याज के अलावा, डीएनए टीकाकरण से बाहर कर दिया गया है वायरल रोगों के खिलाफ मछली छुटकारा के लिए एक सुविधाजनक तरीका है । मछली संक्रामक टेम परिगलन वायरस (IHNV) के खिलाफ एक टीका २००५ के बाद से वाणिज्यिक उपयोग में किया गया है, और संक्रामक अग्नाशय परिगलन वायरस (IPNV) के खिलाफ एक टीके हाल ही में3लाइसेंस प्राप्त था । इसके अलावा, मछली रोगजनकों के खिलाफ कई डीएनए टीके विकसित किया जा रहा है ।
के रूप में पारंपरिक टीके अक्सर निष्क्रिय या जीना क्षीणन रोगजनकों होते हैं, वे2रोग संचारित करने का एक संभावित जोखिम मुद्रा । डीएनए टीके, बारी में, इस जोखिम को टालना, के रूप में वे प्लाज्मिड एंकोडिंग बैक्टीरियल या वायरल एंटीजन के प्रशासन पर आधारित हैं, बल्कि पूरे रोगज़नक़ से ही2,4। डीएनए टीके डीएनए पुनर्संयोजन तकनीकों के साथ उत्पादित कर रहे हैं, जो वैक्सीन एंटीजन की सटीक डिजाइन और प्रतिजन संयोजन और adjuvants के लचीला निर्माण एक टीके में5निर्माण की अनुमति देता है । इसके अलावा, डीएनए टीकों के उत्पादन में तेजी से है, आसान और अधिक लागत प्रोटीन की तुलना में कुशल-रिकॉमबिनेंट टीके, जो टीके उंमीदवार स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए एक प्रमुख लाभ है आधारित है, लेकिन यह भी, उदाहरण के लिए, महामारी फैलने के मामले में 2.
मछली में, डीएनए टीके के लिए सबसे आम प्रशासन मार्गों intraperitoneal, इंट्रामस्क्युलर हैं, और मौखिक3,6,7, जबकि स्तनधारियों में, चमड़े के नीचे और intradermal मार्गों अतिरिक्त विकल्प2हैं । एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद, administrated डीएनए plasmids प्रशासन साइट पर कोशिकाओं में प्रवेश (जैसे, ज्यादातर myocytes, लेकिन यह भी निवासी प्रतिजन-कोशिकाओं को पेश [APCs]). transfected कोशिकाओं का अनुपात काफी electroporation2,8से बढ़ सकता है । सेल में प्रवेश करने के बाद, कुछ प्लाज्मिड डीएनए नाभिक है, जहां प्लाज्मिड द्वारा इनकोडिंग जीन2प्रतिलिखित रहे है में प्रवेश करती है । इस प्रोटोकॉल में, हम pCMV-EGFP प्लाज्मिड कि एक मजबूत सर्वव्यापी eukaryotic अभिव्यक्ति9के लिए अनुकूलित प्रमोटर है का उपयोग । इस निर्माण में, एंटीजन एक GFP के साथ एक फ्यूजन प्रोटीन के रूप में अनुवाद कर रहे हैं । GFP जीवित मछली में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिजन अभिव्यक्ति के सरल दृश्य द्वारा एक सफल टीकाकरण और सही प्रतिजन उत्पाद की पुष्टि करने के लिए सक्षम बनाता है ।
स्तनधारियों में, डीएनए टीके transfected कोशिका प्रकार2,5के आधार पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विभिंन प्रकार को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है । Transfected myocytes गुप्त प्रतिजनों extracellular अंतरिक्ष में या उंहें सेल मौत पर रिलीज, और APCs से घिरा एंटीजन हैं, बाद में, प्रमुख histocompatibility परिसर द्वितीय अणुओं2पर प्रस्तुत किया । यह CD4 और सीडी 8 टी सेल प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से, बी सेल प्रतिक्रियाओं के अलावा2,5,10से चलाता है । मछली में, टी और बी लिम्फोसाइटों, साथ ही वृक्ष कोशिकाओं (dc), की पहचान की गई है, अभी तक प्रतिजन प्रस्तुति में परिश्रम के अपने विभाजन कम अच्छी तरह से11समझा है । Zebrafish dc, तथापि, अपने स्तनधारी समकक्षों के साथ12संरक्षित phenotypic और कार्यात्मक विशेषताओं साझा करने के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, डीएनए टीकाकरण मछली में इसी तरह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और स्तनधारियों में, टी और बी सेल प्रतिक्रियाएं6,13,14,15,16 सहित, बटोरना दिखाया गया है .
लार्वा और वयस्क zebrafish दोनों ही व्यापक रूप से विभिन्न संक्रामक रोगों के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जैसे कि मछली एम marinum संक्रमण मॉडल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तपेदिक के17,18,19,20 ,२१,२२. स्तनधारी मॉडल जीवों के साथ तुलना में, zebrafish के फायदे उनके छोटे आकार, तेजी से reproducibility, और कम आवास खर्च23शामिल हैं । इन पहलुओं zebrafish उपंयास टीकों और दवा यौगिकों23,24,25के लिए बड़े पैमाने पर नैदानिक जांच अध्ययन के लिए एक आदर्श पशु मॉडल बनाते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे उपंयास mycobacteriosis के खिलाफ टीका प्रतिजन उंमीदवारों वयस्क zebrafish के डीएनए आधारित टीकाकरण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । सबसे पहले, हम वर्णन कैसे एंटीजन pCMV-EGFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, वैक्सीन plasmids और मांसपेशी में बाद में electroporation के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा पीछा में क्लोन कर रहे हैं । प्रत्येक प्रतिजन की अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक सप्ताह postimmunization द्वारा की पुष्टि की है । antigen उंमीदवारों की प्रभावकारिता तो प्रायोगिक रूप से एम marinumके साथ टीके को संक्रमित द्वारा परीक्षण किया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pCMV-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475-2L</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02445.2500</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Pulling of needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet PCR Purification kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP ELISA kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td>AKR-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate (FW 118.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>imagej.net/Downloads</td>
			<td></td>
			<td>freely available software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MA-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AZ100</td>
			<td>fluorescense microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ZS61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>E404-200TABL.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114537-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV830 Phneumatic Pico Pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>ID:12163</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (FW294.1)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27833.294</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Inc.</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040-100g</td>
			<td>anestesia and euthanasia solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base) (FW121.14)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX 450165</td>
			<td>tweezer type electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mmCeramic beads</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646-3</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Tough tubes with caps</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-649</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate capillaries</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 20 &#181;l</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 16 mm</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swan Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td>laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam workbench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines

पिछले दो दशकों के दौरान डीएनए आधारित टीकाकरण में रुचि बढ़ गई है । डीएनए टीकाकरण एक प्लाज्मिड, जो एक दर्जी और सुरक्षित डिजाइन सक्षम बनाता है में एक चयनित प्रतिजन या एंटीजन का एक संयोजन के अनुक्रम की क्लोनिंग पर आधारित है । मेजबान कोशिकाओं में डीएनए टीके के प्रशासन प्रतिजनों कि दोनों विनोदी और कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित की अभिव्यक्ति की ओर जाता है । यह रिपोर्ट pCMV-EGFP प्लाज्मिड में antigen अनुक्रम की क्लोनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, इंट्रामस्क्युलर microinjection द्वारा वैक्सीन उंमीदवारों के साथ वयस्क zebrafish के प्रतिरक्षण, और बाद electroporation सेवन में सुधार करने के लिए । वैक्सीन एंटीजन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं (GFP)-फ्यूजन प्रोटीन, जो लाइव मछली से यूवी प्रकाश के तहत प्रतिजन अभिव्यक्ति की पुष्टि और एलिसा के साथ फ्यूजन प्रोटीन के अभिव्यक्ति के स्तर के ठहराव की अनुमति देता है, साथ ही एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के साथ उनका पता लगाने । वैक्सीन उम्मीदवारों के सुरक्षात्मक प्रभाव माइकोबैक्टीरियम marinum पांच सप्ताह postvaccination के साथ मछली को संक्रमित द्वारा परीक्षण किया जाता है, qPCR के साथ बैक्टीरिया की ठहराव के बाद चार सप्ताह बाद. स्तनधारी नैदानिक स्क्रीनिंग मॉडल की तुलना में, इस विधि उपंयास डीएनए के प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी विधि एक माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ टीका उंमीदवारों आधारित प्रदान करता है । विधि को और अधिक विभिन्न जीवाणु और वायरल रोगों के खिलाफ डीएनए आधारित टीके को परखने के लिए लागू किया जा सकता है ।

वयस्क zebrafish के डीएनए टीकाकरण प्रोटोकॉल में शामिल कदम चित्रा 3में सचित्र हैं । सबसे पहले, चयनित प्रतिजन अनुक्रम एक pCMV में क्लोन कर रहे हैं-EGFP प्लाज्मिड और प्लाज्मिड डीएनए का उत्पादन किया और शुद्ध24 (चित्रा 3) है । वैक्सीन उंमीदवारों तो एक microinjector और इंजेक्शन साइट के साथ पेशी इंजेक्शन है कोशिकाओं में प्लाज्मिड के सेवन में सुधार करने के लिए electroporated है (चित्रा 3) । इस्तेमाल किया टीकाकरण खुराक pCMV-EGFP प्लाज्मिड की अलग मात्रा में इंजेक्शन और एलिसा (अनुपूरक चित्रा 1) के साथ GFP अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा अनुकूलित किया गया था । दो से सात दिन postvaccination, फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति यूवी प्रकाश के तहत पता चला है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 और चित्रा 4) के साथ visualized. भिन्न antigen के व्यंजक स्तर बहुत गहन (antigen 1) से एक बेहोश व्यंजक (आरेख 4) के लिए भिन्न हो सकते हैं । इसके अलावा, GFP अभिव्यक्ति पृष्ठीय मांसपेशी (प्रतिजन 1), या एक और अधिक सीमित क्षेत्र (प्रतिजन 2) (चित्रा 4) में देखा जा सकता है । हालांकि, अगर कोई प्रतिदीप्ति 10 दिनों के भीतर पता चला है, यह सुनिश्चित करें कि वहां antigen क्लोनिंग या प्राइमर डिजाइन में कोई गलतियां कर रहे है की सिफारिश की है । यह पुष्टि करने के लिए कि व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन सही आकार का है, प्रोटीन इंजेक्शन साइट के आसपास मांसपेशी ऊतक से निकाला जा सकता है और एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया ।
वैक्सीन उंमीदवारों के प्रभाव एक intraperitoneal इंजेक्शन (चित्रा 5) द्वारा एम marinum की एक कम खुराक के साथ मछली को चुनौती देकर मूल्यांकन किया है । चार से पांच सप्ताह postinfection, बैक्टीरियल गिनती qPCR के साथ निर्धारित कर रहे हैं और नियंत्रण समूह में बैक्टीरियल भार की तुलना में (चित्रा 5). इसके अलावा, सबसे होनहार वैक्सीन उंमीदवारों की प्रभावशीलता एक उच्च खुराक एम marinum संक्रमण(चित्रा 5) के बाद अस्तित्व की निगरानी द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । हालांकि, संक्रमण की प्रगति पर एक मात्रात्मक परिणाम देने के अलावा, के बजाय केवल जिंदा या मृत की एक स्थिति, qPCR-आधारित cfu ठहराव कम समय और छोटे समूह के आकार की आवश्यकता है और है, इसलिए, एक प्राथमिक के लिए एक और अधिक नैतिक दृष्टिकोण स्क्रीन. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल 12 हफ्तों के भीतर उपंयास वैक्सीन एंटीजन की प्रभावशीलता की स्क्रीनिंग (चित्रा 5) की सुविधा ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig1.jpg"> चित्रा 1: क्लोज़ अप (12X) aluminosilicate सुई के वयस्क zebrafish इंट्रा पेशी इंजेक्शन में इस्तेमाल किया । नीचे टिप चिमटी के साथ काट दिया गया है और microinjections के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है । यह आंकड़ा Oksanen३५से अनुकूलित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig2.jpg"> चित्रा 2: Microinjection उपकरण और सेट अप । वयस्क zebrafish के डीएनए टीकाकरण के लिए आवश्यक उपकरणों के मुख्य घटक बोल्ड में हाइलाइट किए गए हैं । महत्वपूर्ण समायोजन इंगित किए गए हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig3.jpg"> चित्रा 3: डीएनए वैक्सीन plasmids और प्रतिरक्षण प्रक्रिया की तैयारी । (1) चयनित एंटीजन pCMV-EGFP प्लाज्मिड में GFP टैग के सन्निकट क्लोन कर रहे हैं । (2) टीका निर्माण microbiologically, केंद्रित है, और शुद्ध उत्पादन किया जाता है । (3) प्लाज्मिड के 12 µ जी एक microinjector के साथ एक anesthetized वयस्क zebrafish की पृष्ठीय मांसपेशी में इंजेक्शन है, और इंजेक्शन साइट बाद में ६ ४०-V, ५०-ms दालों के साथ electroporated है । (४) दो से सात दिन postvaccination, प्रतिजन-GFP फ्यूजन प्रोटीन की GFP अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ visualized है । (5) पृष्ठीय मांसपेशी के फ्लोरोसेंट भाग को विच्छेदित किया जा सकता है और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है । संलयन प्रोटीन के आकार एक पश्चिमी दाग विश्लेषण और GFP के साथ अभिव्यक्ति स्तर-एलिसा के साथ की पुष्टि की है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2.jpg"> चित्रा 4: antigen-EGFP फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति visualizing । Anesthetized वयस्क zebrafish प्रायोगिक वैक्सीन एंटीजन के 12 µ जी के साथ टीका लगाया जाता है (प्रतिजन 1 – 3) और इंजेक्शन साइट electroporated है, बाद में, ६ ४० वी, ५० एमएस दालों के साथ. दो से सात दिन postvaccination, इंजेक्शन साइट एक खुर्दबीन के साथ छवि है । सबसे पहले, GFP की अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत पता चला है । क्षेत्र एक 2x परिमाण उद्देश्य का उपयोग कर निरीक्षण किया है और छवि और. tiff फार्म में बचाया । एक ही क्षेत्र के प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवि के साथ विलय कर रहा है । प्रतिजनों और व्यक्तिगत मछली के बीच की मात्रा और antigen व्यंजक की स्थिति भिन्न हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, antigen 1 की अभिव्यक्ति पृष्ठीय मांसपेशी में स्वीकार्य है और antigen 2 की अभिव्यक्ति को छोटे धब्बे के रूप में देखा जाता है, जबकि antigen 3 एक अधिक सीमित क्षेत्र में दृढ़ता से व्यक्त किया जाता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig5.jpg"> चित्रा 5: एक माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ वैक्सीन उंमीदवारों की प्रभावशीलता का परीक्षण । (1) वयस्क zebrafish mycobacteriosis के खिलाफ प्रयोगात्मक डीएनए टीके के साथ टीका लगाया जाता है । (2) पांच सप्ताह postvaccination, मछली माइकोबैक्टीरियम marinum (~ 30 cfu) की एक कम खुराक से संक्रमित हैं । (3) चार सप्ताह बाद आंतरिक अंगों को विच्छेदित कर लिया जाता है और डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जाता है । (4) प्रत्येक मछली में जीवाणु गिनती एम. marinum-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग qPCR के साथ quantified है । antigen 1 के साथ प्रतिरक्षण बैक्टीरियल गणना (p < ०.०१, दो-तरफ़ा ANOVA) में एक महत्वपूर्ण कमी करने के लिए नेतृत्व किया, जबकि एंटीजन 2 और 3 कोई प्रभाव नहीं था । (5) सबसे होनहार वैक्सीन उंमीदवार के सुरक्षात्मक प्रभाव (प्रतिजन 1) आगे एक अस्तित्व प्रयोग में मूल्यांकन किया जाता है, जहां मछली एक उच्च खुराक से संक्रमित कर रहे हैं (~ १०,००० cfu) बैक्टीरिया और उनके अस्तित्व के लिए निगरानी की जाती है 12 सप्ताह. बैक्टीरियल बोझ में कमी के अनुरूप 4पैनल में मनाया, प्रतिजन 1 के साथ टीकाकरण भी एक एम. marinum संक्रमण पर मछली के अस्तित्व में सुधार (पी < 0.01), इस प्रतिजन का सुझाव एक होनहार हो सकता है क्षय रोग के खिलाफ एक उपंयास वैक्सीन के लिए उंमीदवार । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/58453/58453figS1.jpg"> अनुपूरक चित्रा 1: प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा वयस्क zebrafish में प्लाज्मिड-व्युत्पन्न EGFP अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है । मछली के समूह (n = प्रत्येक समूह में 5) के साथ इंजेक्शन थे 0.5 – 20 μg के pCMV-EGFP, और electroporation (५० वी के छह दालों) अभिकर्मक बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नियंत्रण मछली (CTRL) EGFP जीन युक्त नहीं प्लाज्मिड खाली pCMV के 2 μg के साथ इंजेक्शन थे । GFP-एलिसा मछली homogenates में रिश्तेदार EGFP अभिव्यक्ति को परिभाषित करने के लिए 3 दिन postinjection प्रदर्शन किया था । p-मान: *p < 0.03, * *p < 0.004 । त्रुटि-पट्टियां मानक विचलन दर्शाती हैं । एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है । यह आंकड़ा Oksanen३५से अनुकूलित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453figS1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines at JoVE.com

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

डीएनए आधारित टीकों की नैदानिक जांच के लिए वयस्क Zebrafish का प्रतिरक्षण

यहाँ हम डीएनए आधारित वैक्सीन के साथ वयस्क zebrafish (ढाणियो rerio) के प्रतिरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और एक सफल टीकाकरण घटना के सत्यापन का प्रदर्शन करते हैं. यह विधि विभिन्न संक्रमण मॉडलों में वैक्सीन उम्मीदवारों के नैदानिक स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है ।

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

हम तपेदिक के खिलाफ उपन्यास वैक्सीन उम्मीदवारों की खोज करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, लेकिन मुझे अन्य संक्रामक बीमारियों पर लागू किया जा सकता है। स्तनधारी मॉडलों की तुलना में यह विधि उपन्यास डीएनए आधारित वैक्सीन उम्मीदवारों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन Hannaleena Piippo, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।शुरू करने के लिए, ध्रुवीय बार में वी-नाली में ग्लास केशिका सेट करें और क्लैंपिंग घुंडी को हल्के से कस दें। फिलामेंट के बगल में धारक को ले जाएं और धीरे-धीरे केशिका को फिलामेंट के माध्यम से और फिलामेंट के दूसरी तरफ ध्रुवीय बार में धकेलें। इसके बाद, क्लैंपिंग नॉब्स को कस लें, सेफ्टी ग्लास सेट करें, और पुल बटन दबाएं।इसके बाद, सुई युक्तियों की रक्षा के लिए एक पेट्री डिश के अंदर पुन: प्रयोज्य चिपकने वाले के एक टुकड़े पर सुई रखें। सबसे पहले, इंजेक्शन मिश्रण 0.5 से 12 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड प्रति खुराक का उपयोग करके तैयार करें। समूह में मछली की संख्या के लिए मास्टर मिश्रण की उचित मात्रा तैयार करें।उचित धारक पर टेप के एक टुकड़े के चिपचिपा पक्ष पर केशिका सुई रखें। इसके बाद, प्रयोगशाला फिल्म के एक टुकड़े पर प्लाज्मिड खुराक की पिपेट बूंदें। इसके बाद, फिल्म से प्लाज्मिड बूंदों को सुई में स्थानांतरित करने के लिए लोडिंग टिप का उपयोग करें।सुई में हवा के बुलबुले को पाइपिंग से बचने के लिए धीरे-धीरे और सावधानी से पिपेट करें। माइक्रो मैनिपुलेटर और एक प्रकाश स्रोत की स्थिति। इसके बाद एयर प्रेशर टैप को ओपन पोजिशन पर स्विच करें।माइक्रो इंजेक्टर फ्रंट पैनल पर समय पर मोड का उपयोग करके पल्स की लंबाई को 10 सेकंड तक समायोजित करें। फिर, 10-टर्न अवधि डायल के साथ पल्स लेंथ को ठीक ट्यून करें। इसके बाद, माइक्रो मैनिपुलेटर के माइक्रो पिपेट धारक पर सुई सेट करें।तरल को बाहर धकेलने की अनुमति देने के लिए सुई की नोक को काटने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और सुई की स्थिति का आकलन करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। रिमोट फुट स्विच को एक बार यह सत्यापित करने के लिए दबाएं कि एक सेकंड की नाड़ी सुई से एक छोटी बूंद को धक्का देती है। इसके बाद इलेक्ट्रोपोरेटर सेटिंग्स को एडजस्ट करें और चिमटी को इलेक्ट्रोपोरेटर से कनेक्ट करें।इंजेक्शन के दौरान मछली को एक निश्चित स्थिति में रखने के लिए पैडिंग के रूप में बीच में एक नाली कट के साथ स्पंज के एक टुकड़े का उपयोग करें। स्पंज को सिस्टम वॉटर में अच्छी तरह से भिगोकर पेट्री डिश में सेट कर लें। एक प्लास्टिक चम्मच का उपयोग करके, एक एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश को गीले स्पंज में मछली के वेंट्रल साइड के साथ नाली में नीचे स्थानांतरित करें।माइक्रोस्कोप के नीचे सुई को जेब्राफिश की पृष्ठीय मांसपेशी के करीब 45 डिग्री कोण पर रखें, फिर पृष्ठीय पंख के सामने तराजू के बिना छोटे स्थान को ढूंढें और सुई को मांसपेशियों में धकेल दें। यदि कोई प्रतिरोध महसूस किया जाता है तो एक आसन्न स्थान की कोशिश करें। मांसपेशियों में प्लाज्मिड समाधान को धीरे-धीरे इंजेक्ट करने के लिए पैर स्विच का उपयोग करें।माइक्रोस्कोप के नीचे फिनॉल लाल दिखाई देना चाहिए क्योंकि यह मांसपेशियों के ऊतकों में प्रवेश करता है। इंजेक्शन साइट के प्रत्येक तरफ चिमटी-प्रकार के इलेक्ट्रोड रखकर इंजेक्शन के तुरंत बाद मछली को इलेक्ट्रोपोरेट करें। इलेक्ट्रोपोरेटर पर स्टार्ट बटन दबाएं और इसे छह 40 वोल्ट 50 मिलीसेकंड दालें दें।फिर, धीरे से मछली को एक रिकवरी टैंक में स्थानांतरित करें। अंत में, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार मछली को एनाथिफिशइज़ करने के बाद, इंजेक्शन साइट के पास ईजीएफपी अभिव्यक्ति देखने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल में एक्सप्रेशन वेक्टर में जीएफपी से सटे डीएनए एंटीजन का क्लोन बनाया गया था।जेब्राफिश को डीएनए एंटीजन प्लाज्मिड्स के साथ माइक्रो इंजेक्टर के साथ इंजेक्ट किया गया था, और कोशिकाओं में प्लाज्मिड के सेवन को बेहतर बनाने के लिए इंजेक्शन साइट को इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था । इमेजिंग के लिए, एंटीजन अभिव्यक्ति को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना की जा सकती है। इस मामले में, इंजेक्शन साइट के पास तीनों एंटीजन जीएफपी फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता चला, हालांकि उनकी तीव्रता भिन्न थी।माइकोबैक्टीरियल एंटीजन के साथ प्रतिरक्षण के पांच सप्ताह बाद जेब्राफिश माइकोबैक्टीरियम मैरिनियम से संक्रमित थे। QPCR संक्रमण के चार सप्ताह बाद प्रत्येक मछली में बैक्टीरियल बोझ निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । नियंत्रण समूह की तुलना में, एंटीजन एक के साथ प्रतिरक्षित मछली एम मैरिनम के साथ संक्रमण के बाद एक कम जीवाणु भार दिखाया ।इस विधि को निष्पादित करते समय प्लाज्मिड निर्माण को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना, एंटीजन की अभिव्यक्ति को मान्य करना और बड़े पैमाने पर प्रयोगों से पहले इंजेक्शन तकनीक का अभ्यास करना महत्वपूर्ण है। यह तकनीक वयस्क जेब्राफिश में उपन्यास डीएनए आधारित वैक्सीन उम्मीदवारों की लागत प्रभावी प्री-क्लीनिकल स्क्रीनिंग का मार्ग प्रशस्त कर सकती है। यह न भूलें कि जानवरों का कल्याण बहुत महत्वपूर्ण है, और इस प्रक्रिया को करते समय उचित संज्ञाहरण आवश्यक है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

हैम्स्टर्स की पृष्ठीय त्वचा में cutaneous लीशमनियासिस: Antileishmanial ड्रग्स की जांच के लिए एक उपयोगी मॉडल

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

टीके के लिए माउस जवाब में nasopharyngeal जुड़े Lymphoreticular ऊतक (NALT) की भूमिका की जांच

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

निर्देशित थर्मास्टाइबल जीवाणुलयनी एंजाइमों के विकास के लिए एक नई स्क्रीनिंग पद्धति

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

के 4D multimodality इमेजिंग<em&gt; Citrobacter rodentium</emचूहे में&gt; संक्रमण

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

इम्यून से समझौता वयस्क zebrafish में सामान्य और घातक मांसपेशी कोशिका प्रत्यारोपण

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Chimeric माउस मॉडल में संयोजक फ्लू के टीके की intranasal प्रशासन mucosal प्रतिरक्षण अध्ययन करने के लिए

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

बढ़ाता Vibrio हैजा औपनिवेशीकरण और दस्त वयस्क Zebrafish मॉडल में

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...