Name: immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines
Uploaded: 2018-10-30T14:45:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines at JoVE.com

Авторы благодарны членам исследовательской группы экспериментальной иммунологии, и особенно Leena Мякинен и Hannaleena Piippo, за всю работу они сделали в разработке и оптимизации протокола вакцинации и их помощь в реальных экспериментов использование протокола.
Эта работа была поддержана Джейн ja Aatos Erkon Säätiö (Джейн и Фонд Эркко Aatos; для м.р.), Сигрид Juséliuksen Säätiö (Сигрид Juselius фонд; чтобы м.р.), конкурентные государственное финансирование исследований из области ответственности эксперт Университета Тампере Больница (чтобы м.р.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Тампере туберкулезом фонд; чтобы м.р., его Величество и м.н.), Suomen Kulttuurirahasto (финский культурный фонд; чтобы H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (финский противотуберкулезных Фонд; для его Величества) Вяйно ja Laina Kiven säätiö (Laina Kivi фонд; и Вяйно к м.н.) и Тампере город научным фондом (м.н.).

<ol>
	<li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response.">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).</li><li>Tregoning, J. S., Kinnear, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Plasmids+as+DNA+Vaccines+for+Infectious+Diseases.">Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Evensen, O., Leong, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+against+viral+diseases+of+farmed+fish.">DNA vaccines against viral diseases of farmed fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).</li><li>Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vaccine+directed+against+a+rainbow+trout+rhabdovirus+induces+early+protection+against+a+nodavirus+challenge+in+turbot.">A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot.</a> Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).</li><li>Li, L., Petrovsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+for+enhanced+DNA+vaccine+immunogenicity.">Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).</li><li>Embregts, C. W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+DNA+Vaccination+of+Juvenile+Carp+against+Spring+Viremia+of+Carp+Virus+Induces+Full+Protection+and+Establishes+a+Virus-Specific+B+and+T+Cell+Response.">Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).</li><li>Lorenzen, N., LaPatra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+for+aquacultured+fish.">DNA vaccines for aquacultured fish.</a> Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).</li><li>Oksanen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+zebrafish+model+for+preclinical+tuberculosis+vaccine+development.">An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development.</a> Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).</li><li>Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+as+a+predominant+mechanism+for+inducing+CD8(+)+T+cell+responses+in+gene+gun+DNA+immunization.">Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization.</a> The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).</li><li>Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+antigen+presenting+cells+in+zebrafish.">Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).</li><li>Shao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+surface+phenotypic+molecules+of+teleost+dendritic+cells.">Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).</li><li>Utke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+immune+responses+in+rainbow+trout+after+DNA+immunization+against+the+viral+hemorrhagic+septicemia+virus.">Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).</li><li>Cuesta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+DNA+vaccine+against+infectious+pancreatic+necrosis+virus+(IPNV)+with+a+different+mode+of+action+than+fish+rhabdovirus+DNA+vaccines.">An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines.</a> Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).</li><li>Castro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+against+a+fish+rhabdovirus+promotes+an+early+chemokine-related+recruitment+of+B+cells+to+the+muscle.">DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle.</a> Vaccine. 32 (10), (2014).</li><li>Iwanami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+understanding+the+evolution+of+the+vertebrate+immune+system+and+human+primary+immunodeficiency.">Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).</li><li>Patterson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+model+of+bacterial+meningitis+in+Streptococcus+agalactiae+infection.">Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).</li><li>Cronan, M. R., Tobin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fit+for+consumption:+zebrafish+as+a+model+for+tuberculosis.">Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis.</a> Disease Model &amp; Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Parikka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+causes+a+latent+infection+that+can+be+reactivated+by+gamma+irradiation+in+adult+zebrafish.">Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish.</a> PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).</li><li>Rounioja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defense+of+zebrafish+embryos+against+Streptococcus+pneumoniae+infection+is+dependent+on+the+phagocytic+activity+of+leukocytes.">Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).</li><li>Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Breathes+New+Life+into+the+Study+of+Tuberculosis.">The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis.</a> Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).</li><li>Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Myllymaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antigen+candidates+for+a+tuberculosis+vaccine+in+the+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).</li><li>Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+postexposure+mycobacterial+vaccine+antigens+using+an+immunosuppression-based+reactivation+model+in+the+zebrafish.">Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish.</a> Disease Model &amp; Mechanisms. 11 (3), (2018).</li><li>Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccines+for+targeting+bacterial+infections.">DNA vaccines for targeting bacterial infections.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+AUG+and+alternative+initiator+codons+is+augmented+by+G+in+position++4+but+is+not+generally+affected+by+the+nucleotides+in+positions++5+and++6.">Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6.</a> The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Charan, J., Kantharia, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+calculate+sample+size+in+animal+studies?.">How to calculate sample size in animal studies?.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).</li><li>Hammaren, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adequate+Th2-type+response+associates+with+restricted+bacterial+growth+in+latent+mycobacterial+infection+of+zebrafish.">Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish.</a> PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).</li><li>Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+adult+zebrafish.">Electroporation of adult zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 423, 289-298 (2008).</li><li>McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles:+an+innovative+platform+for+gene+delivery.">Microneedles: an innovative platform for gene delivery.</a> Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).</li><li>Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+study+of+in+situ+expression+of+antigens+following+DNA-vaccination+against+VHS+in+rainbow+trout+(Oncorhynchus+mykiss+Walbaum)+fry.">Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry.</a> Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).</li><li>Oksanen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+Model+for+Studying+DNA-based+Vaccination+against+Mycobacterial+Disease.">Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease.</a> Tampereen yliopisto. , (2011).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Процедура иммунизации взрослых данио рерио с вакцин на основе ДНК требует некоторых технических знаний. Даже для опытного исследователя вакцинация одной рыбы занимает около 3 минут, за исключением препаратов. Таким образом максимум примерно 100 рыбы могут быть иммунизированы в течение дня. Если более чем 100 рыбы необходимы для эксперимента, прививки можно разделить между до 3 дней. Помимо качества эксперимента достаточную подготовку по researcher(s) для обработки рыбы и проведения иммунизации имеет важное значение для благополучия рыбы. Убедитесь в том следовать местные правовые и животных благосостояния правила и руководящие принципы, когда речь заходит о жилье рыбы, планирования экспериментов и квалификацией, необходимой для персонала, проведение экспериментов.
В целом существует несколько важных шаги, чтобы избежать осложнений в протоколе иммунизации. Для успешного проведения иммунизации, убедитесь, что 1) рыбу, чтобы быть иммунизированы здоровым и достаточно в возраст и размер (иммунизации более молоди может потребовать вниз масштабирования объема вакцины и параметры электропорации); 2) рыба должным образом под наркозом с без сильнее, чем 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилового эфира, и они по-прежнему наркотизированных на протяжении всей процедуры (анестезии следует максимально обеспечить восстановление рыбы); 3) Губка pad является правильно пропитанные; 4) Жидкость впрыскивается в каждом импульсе от пневматического насоса и, если нет, длительность импульса корректируется (потянув иглу немного назад вдоль оси y может помочь); 5) Существует нет пузырьков воздуха с решением вакцины; 6) электропорации параметров и фактических импульса напряжения и длина являются правильными; 7) электродов не вызывают повреждение кожи на сайте электропорации (во время электропорация, держать электродов в нежный связаться с рыбой и освободить рыбу непосредственно в резервуар восстановления после электропорации).
Это важно для мониторинга рыб после электропорации в баке восстановления и усыпить любой рыбы, признаки дискомфорта. Кроме того необходимо на практике процедура перед началом крупномасштабного эксперимента, чтобы свободно рабочего процесса. Если возможно попросите помощи с заполнением иглы и электропорации достаточно подготовленных коллега.
Метод вакцинации ДНК позволяет индивидуальный дизайн антигенов вакцины. Это позволяет клонировать весь антиген или, желательно, выбрать части антигена, основанный на клеточной локализации и иммуногенности24. Кроме того метод позволяет объединения нескольких антигены или адъювантов в одной вакцины конструкции или инъекционных несколько отдельных плазмид на же время2. Включая кодоном остановка после последовательности антиген или вырезание EGFP ген от плазмида можно использовать же вектор плазмиды также выразить антигена без последующего N-терминальный GFP-тега. Это может быть разумным в подтверждающих позитивные скрининг результаты, как относительно большой размер GFP может повлиять на складывающиеся антигена и, таким образом, ограничить гуморальные ответы, потенциально вызывали путем вакцинации.
Выражение выше антигена были связаны с иммуногенность вакцины ДНК2. Электропорация после инъекции таким образом, была включена в этот протокол, как это было показано в четыре раза увеличить выражение антигены или репортер генов в zebrafish32в десять раз. Кроме того электропорация как метод вызывает умеренные ткани травмы, таким образом вызывая местного воспаления, что далее способствует вакцины индуцированной иммунные реакции2. С другой стороны электропорация обычно хорошо переносится. С оборудование, используемое здесь практически 100% взрослых рыбок данио будет восстанавливаться хорошо шести импульсов 40 V, используемые в этот протокол35.
Помимо расширения запись плазмида вакцины в клетки с помощью электропорации, мы используем сильные повсеместно промоутер в плазмиду вакцины и хвост поля в конце 3' антигена для улучшения выражение антигена в клетках transfected рыбы. В некоторых случаях если кодон использование целевых возбудителя значительно отличается от прививки видов, кодон оптимизации был признан полезным для дальнейшего увеличения целевого гена выражение2. В этой моделим. marinum данио рерио - однако, кодон оптимизации не оказало существенного влияния на уровни выражения двух генов микобактериальной модель, ESAT-6 и СЛП-10 и таким образом, было сочтено ненужным в этой модели35 .
Целевой ген выражение профили имеют некоторые временные вариации между антигенами, в зависимости, например, размер и структура антигенов в вопросе. Однако выражение антигена обычно похож внутри группы рыб, иммунизированных вакциной же. Как правило яркое выражение EGFP наблюдается четыре дня до одной недели postvaccination, но возможен в масштабе 2 – 10 дней. Рекомендуется для проверки выражения каждого антиген EGFP синтез белка в небольшой группе рыбы (2 – 3) перед включая антигена в масштабный эксперимент. Если выражение не GFP наблюдается в любой точке 2 – 10 дней после вакцинации, убедитесь, что 1) протокол иммунизации был тщательно следовать. Всегда есть группы рыб, иммунизированных с пустой pCMV-EGFP плазмида как позитивный элемент управления и убедитесь, что 2) антигена дизайн и молекулярное клонирование было осуществлено правильно (адекватные грунтовка дизайн; антиген и EGFP тег находятся в том же рамка чтения и не вмешиваясь кодонов стоп включены). В некоторых случаях, несмотря на правильные антигена дизайн не могут быть обнаружены GFP. Это может быть связано неправильное складывание или Быстрый распад синтез белка. В этих обстоятельствах может потребоваться перестроить антигена.
В вакцины, используемые для иммунизации рыбные плазмида дозировка составляет обычно 1 мкг или менее7,,3334. В данио рерио репортер экспрессии генов может быть также обнаружен после по крайней мере 0,5 мкг плазмида инъекции после электропорации; Однако экспрессии генов относительный целевой значительно увеличивается с большее количество плазмида за рыбы (дополнительный рис. 1). В рыбе, вводится с репортером плазмида pCMV-EGFP инъекции с 5 – 20 мкг плазмида привели к четырех до восьми раз выше EGFP уровней по сравнению с рыбы, вводят 0,5 мкг. Таким образом чтобы обеспечить достаточно высокий целевой экспрессии генов, но иметь инъекции томов, которые являются достаточно мал (≤7 мкл), чтобы не повредить избыточной ткани или утечки вакцины, мы решили использовать 5-12 мкг на рыбы для целей предварительного отбора. В дополнение к иммуногенность вакцины, высокий, требуется достаточно целевое выражение гена для выявления экспрессии гена репортера с флуоресцентным микроскопом и Западная помарка, которая необходима для скрининга целей для подтверждения правильного в естественных условиях перевод целевой антигена. Однако, Нижняя плазмида дозы (0,5 – 1 мкг) может быть полезным для других типов экспериментальных видов использования.
В заключение этот протокол для иммунизации взрослых данио рерио с плазмида ДНК может использоваться в доклинических испытаний новых вакцин-кандидатов против различных бактериальных или вирусных инфекций. Выражение антигена вакцины как белка GFP-фьюжн позволяет визуализировать успешного иммунизации событий и антиген выражения. Мы применяем этот метод для доклинических скрининга кандидатов антигена Роман вакцины против туберкулеза. Для этого мы заразить данио рерио пять недель postvaccination и определить, что бактериальные подсчитывает в каждой рыбы с ПЦР20,24.

Первые исследования вакцины ДНК были проведены в 1990-х1, и с тех пор, были протестированы ДНК-вакцин против различных инфекционных заболеваний, рака, аутоиммунные заболевания и специальные2. В млекопитающих ДНК вакцины против вируса Западного Нила в лошадей и терапевтических рака вакцины для собак устные меланома был лицензирован, но они не являются в настоящее время в клинической практике2. В дополнение к интерес вызывали у млекопитающих исследований ДНК вакцинации оказался быть удобным способом для иммунизации рыбные против вирусных заболеваний. Вакцина против вируса инфекционного некроза гемопоэтических рыбы (IHNV) был в коммерческого использования с 2005 года, и вакцина против инфекционной панкреонекроза вируса (IPNV) был недавно лицензированных3. Кроме того в настоящее время разрабатываются несколько ДНК-вакцин против патогенов рыбы.
Как традиционные вакцины часто содержат инактивированных и живых аттенуированных патогенов, они представляют потенциальный риск передачи болезни2. ДНК-вакцин, в свою очередь, предотвратить этот риск, поскольку они основаны на администрации плазмида кодирования бактериальных или вирусных антигенов, вместо того, чтобы весь патогена, сам2,4. ДНК-вакцин производятся с методами рекомбинации ДНК, которые позволяет точный дизайн антигенов вакцины и гибкой формулировке антигена комбинаций и адъювантов в одной вакцины построить5. Кроме того производство вакцины ДНК быстрее, проще и более эффективным, чем рекомбинантных вакцин на основе белков, которые является основным преимуществом для вакцины-кандидата, скрининг целей, но и, например, в случае вспышки пандемии 2.
В рыбе наиболее распространенные маршруты администрации для ДНК-вакцин являются внутрибрюшинного, внутримышечное и устные3,6,7, у млекопитающих, на подкожное и внутрикожные маршруты являются дополнительные параметры2. После внутримышечной инъекции, администрируемых ДНК плазмиды введите клетки на сайте администрирования (например., главным образом миоцитов, но и резидентов антиген представляющих клеток [БТР]). Доля transfected клеток может быть значительно увеличена электропорации2,8. После ввода в ячейку, некоторые плазмиды проникает в ядро, где гены, кодируемых плазмида, транскрибируется2. В этом протоколе мы используем плазмида pCMV-EGFP, который имеет сильную повсеместно промоутер, оптимизированный для eukaryotic выражение9. В этой конструкции антигены переводится как синтез белка с GFP. GFP позволяет подтверждение успешной вакцинации и антиген правильный продукт, простой визуализации экспрессии антигена с флуоресцентным микроскопом в живой рыбы.
В млекопитающих ДНК-вакцин было показано для стимулирования различных типов иммунных реакций в зависимости от transfected клеток типов2,5. Transfected миоцитах выделяют антигены во внеклеточное пространство или освободить их после смерти клетки, и антигены, обхватил БТР впоследствии, на гистосовместимости комплекс II молекул2. Это вызывает реакции клеток CD4 и CD8 T, особенно, в дополнение к клетки B ответы2,5,10. В рыбе лимфоцитов T и B, а также дендритных клеток (DCs), было выявлено, но их разделения труда в презентации антигена является менее хорошо понимали11. Данио рерио DCs, однако, было показано поделиться сохранены фенотипических и функциональные характеристики с их коллегами млекопитающих12. Кроме того было показано ДНК вакцинации добиться аналогичных иммунных реакций в рыб и млекопитающих, в том числе T клетки B ответы6,13,,14и15,16 .
Личинки и взрослые данио рерио широко используются для различных инфекционных заболеваний модели, например модель рыбы marinum м. инфекции туберкулеза, используемые в этот протокол17,18,19,20 ,21,22. По сравнению с млекопитающих модельных организмов преимущества у рыбок данио включают их небольшого размера, быстро воспроизводимости и низким жилищные расходы23. Эти аспекты делают данио рерио идеальная модель животных для крупномасштабных доклинических скрининговых исследований для новых вакцин и фармацевтических соединений23,24,25.
В этом протоколе мы описываем как Роман антигенов вакцины кандидатов против микобактериозов могут быть оценены на основе ДНК вакцинация взрослых рыбок данио. Во-первых мы описываем, как антигены клонируются в плазмиду выражение pCMV-EGFP, следуют подробный протокол для внутримышечного введения вакцины плазмиды и последующего электропорации в мышцы. Выражение каждого антигена подтверждается postimmunization одну неделю микроскопии флуоресцирования. Эффективность антигена кандидатов затем проверен экспериментально заразить привитых рыбы с . м. marinum.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pCMV-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475-2L</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02445.2500</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Pulling of needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet PCR Purification kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP ELISA kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td>AKR-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate (FW 118.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>imagej.net/Downloads</td>
			<td></td>
			<td>freely available software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MA-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AZ100</td>
			<td>fluorescense microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ZS61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SFA-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>E404-200TABL.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114537-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV830 Phneumatic Pico Pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>ID:12163</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (FW294.1)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27833.294</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Inc.</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040-100g</td>
			<td>anestesia and euthanasia solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base) (FW121.14)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-500G</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits</td>
			<td>BTX Harvard apparatus</td>
			<td>BTX 450165</td>
			<td>tweezer type electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mmCeramic beads</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-646-3</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Tough tubes with caps</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-649</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate capillaries</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 20 &#181;l</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 16 mm</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swan Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td>laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam workbench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of adult zebrafish for the preclinical screening of dna-based vaccines

За последние два десятилетия возрос интерес к вакцинации на основе ДНК. ДНК вакцинации основан на клонирование последовательности выбранных антиген или сочетание антигенов в плазмиду, который позволяет индивидуальные и безопасный дизайн. Администрация вакцины ДНК в клетки хозяина приводит к экспрессии антигенов, которые стимулируют гуморального и клеточного иммунного ответа. В настоящем докладе описывается протокол для клонирования антигена последовательностей в плазмиду pCMV-EGFP, иммунизации взрослых данио рерио с кандидатами вакцина внутримышечно микроинъекции, и последующего электропорации для улучшения приема. Антигенов вакцины выражаются в виде зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-синтез белков, которые позволяет подтвердить экспрессии антигена под УФ света из живой рыбы и количественная оценка уровня выражения синтез белка с ELISA, а также как их обнаружение с Западный анализ помаркой. Защитный эффект вакцин-кандидатов проверяется путем заражения рыба с Mycobacterium marinum пять недель postvaccination, следуют количественная оценка бактерий с ПЦР через четыре недели. По сравнению с моделями млекопитающих доклинических скрининга, этот метод обеспечивает эффективный метод для предварительного отбора кандидатов Роман на основе ДНК вакцины против микобактериальной инфекции. Метод может применяться для отбора на основе ДНК вакцины против различных бактериальных и вирусных заболеваний.

Этапы в протоколе ДНК вакцинация взрослых рыбок данио показано на рисунке 3. Во-первых выбранный антигена последовательности клонируются в плазмиду pCMV-EGFP и плазмида ДНК производится и очищенного24 (рис. 3). Вакцин-кандидатов затем вводят внутримышечно с microinjector и место инъекции является electroporated для улучшения приема плазмида в клетки (рис. 3). Доза используемых вакцинации был оптимизирован, различное количество pCMV-EGFP плазмиды инъекционных и измерения экспрессия гена GFP с ELISA (Дополнительные рис. 1). Двух до семи дней postvaccination, выражение синтез белка обнаруживается под УФ светом и визуализированы с флуоресцентной микроскопии (рис. 3 и рис. 4). Уровни выражения различных антигенов может варьироваться от очень интенсивный (антиген 1) слабое выражение (рис. 4). Кроме того, могут наблюдаться экспрессия гена GFP в спинной мышечной (антиген 1), или в более ограниченной области (антиген 2) (Рисунок 4). Однако если не флуоресценции обнаружен в течение 10 дней, рекомендуется убедиться, что есть никаких ошибок в антиген клонирования или праймер дизайн. Для подтверждения, что выраженная синтез белка имеет правильный размер, белки может быть извлечено из мышечной ткани вокруг укола и использованы для Западный анализ помаркой.
Влияние вакцин-кандидатов оценивается путем сложной рыбы с низкой дозой м. marinum внутрибрюшинной инъекции (рис. 5). Четыре-пять недель postinfection, бактериальный счетчики определяются с ПЦР и по сравнению с бактериальной нагрузки в группе контроля (рис. 5). Кроме того, эффективность наиболее перспективных вакцин-кандидатов может быть проверена путем наблюдения за выживание после высокая доза инфекции marinum м. ()рис. 5). Однако помимо количественного результата на прогрессирование инфекции, вместо того чтобы просто состояние живых или мертвых, количественной оценки на основе ПЦР cfu требует меньше времени и меньше группы размеров и, следовательно, более этический подход для основного экрана. В целом этот протокол облегчает проверки эффективности антигены Роман вакцины в течение 12 недель (рис. 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig1.jpg"> Рисунок 1: Макро (12 X) алюмосиликатных иглы, используемые в инъекции внутри мышечной взрослых рыбок данио. Подсказки ниже была сокращена с помощью пинцета и готов к использованию для микроинъекций. Этот показатель был адаптирован от Оксанена35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig2.jpg"> Рисунок 2: микроинъекции оборудования и set-up. Основные компоненты оборудования, необходимого для ДНК вакцинация взрослых рыбок данио, выделены жирным шрифтом. Критические изменения указаны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig3.jpg"> Рисунок 3: подготовка ДНК плазмиды вакцин и иммунизации процедуры. (1) выбранные антигены клонируются рядом GFP тег в pCMV-EGFP плазмиды. Конструкция (2) вакцина производится микробиологически, сосредоточены и очищается. (3) 12 мкг плазмидной впрыскивается в спинной мышечной наркотизированных взрослых рыбки данио рерио с microinjector, и инъекции является впоследствии electroporated с шестью 40-V, 50-ms импульсов. (4) два-семь дней postvaccination, экспрессия гена GFP антиген GFP синтез белка визуализируется с флуоресцентным микроскопом. Частью (5) люминесцентная в спинной мышечной можно расчлененные и используется для извлечения белков. Западный анализ помаркой и уровне выражения с GFP-ELISA подтверждают размер синтез белка. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2.jpg"> Рисунок 4: Визуализация выражение антигена EGFP синтез белка. Наркотизированных взрослых рыбок данио привиты с 12 мкг экспериментальной вакцины антигенов (антиген 1 – 3) и место инъекции electroporated, впоследствии, с шестью 40 V, 50 мс импульсов. Двух до семи дней postvaccination, место инъекции образы с помощью микроскопа. Во-первых выражение гена GFP обнаруживается под флуоресцентным микроскопом. Области проверяется с помощью 2 X величины цель и образ и сохранены в форме .tiff. Световой микроскоп изображение того же района объединяются с флуоресцентным изображение с помощью программного обеспечения ImageJ. Количество и положение экспрессии антигена может варьироваться между антигены и отдельных рыб. Например выражение антигена 1 наблюдается через спинной мышечной и выражение антигена 2 рассматривается как небольшие пятна, тогда как антиген 3 решительно выражается в более ограниченной области. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig5.jpg"> Рисунок 5: тестирование эффективности вакцин-кандидатов против микобактериальной инфекции. (1) взрослого данио рерио привиты с экспериментальной ДНК-вакцин против микобактериозов. (2) пять недель postvaccination, рыба, инфицированных с низкой дозой Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3) четыре недели спустя, внутренние органы расчлененные и использован для экстракции ДНК. (4) число бактерий в каждой рыбы количественно с ПЦР, используя marinum м.-конкретных грунтовки. Иммунизации с антигеном 1 привели к значительному уменьшению бактериальной графов (p < 0,01, двустороннюю ANOVA), то время как антигены 2 и 3 было никакого эффекта. (5) защитный эффект наиболее перспективных вакцины-кандидата (антиген 1) далее оценивается в эксперименте выживания, где рыба заражены с высокой дозой (~ 10000 cfu) бактерий и их выживание находится под контролем за 12 недель. В соответствии с снижение бактериальной нагрузки наблюдается в группе 4, вакцинации с антигеном 1 также улучшили выживание рыбы на м. marinum инфекции (p < 0.01), предлагая этот антиген может быть перспективным кандидат в романе вакцины против туберкулеза. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/58453/58453figS1.jpg"> Дополнительный рисунок 1: количество плазмидной ДНК влияет производным плазмиды EGFP выражение в взрослых рыбок данио. Группы рыб (n = 5 в каждой группе) вводили с 0,5 – 20 мкг pCMV-EGFP, и электропорации (шесть импульсов 50 V) был использован для повышения transfection. Управления рыбы (CTRL) вводили с 2 мкг пустой pCMV плазмиды, не содержащие EGFP гена. GFP-ELISA был выполненных 3 дня postinjection для определения относительной EGFP выражения в гомогенатах рыбы. P-значения: *p < 0,03, **p < 0,004. Погрешностей представляют стандартных отклонений. NS = не значительные. Этот показатель был адаптирован от Оксанена35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453figS1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines at JoVE.com

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Иммунизации взрослых рыбок данио доклинические скрининга на основе ДНК вакцин

Здесь мы описываем протокол для иммунизации взрослых рыбок данио (Danio рерио) с помощью вакцины на основе ДНК и демонстрации проверки событий успешной вакцинации. Этот метод подходит для доклинических скрининг вакцин-кандидатов в различных моделях инфекции.

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Мы используем этот протокол для поиска новых кандидатов вакцины против туберкулеза, но я могу быть применен к другим инфекционным заболеваниям. По сравнению с моделями млекопитающих этот метод обеспечивает экономически эффективную процедуру для предварительного скрининга новых кандидатов вакцины на основе ДНК. Демонстрацией процедуры будет Ханналина Пииппо, техник из нашей лаборатории.Для начала установите стеклянную капиллярную крышку в V-groove в полярном баре и слегка затяните ручку зажима. Переместите держатель рядом с нитью и осторожно нажмите капилляр через нить и в полярный бар на другой стороне нити. Затем затяните зажимные ручки, установите защитное стекло и нажмите кнопку шкив.После этого поместите иглы на кусок многоразового клея внутри чашки Петри, чтобы защитить кончики иглы. Во-первых, подготовить смесь инъекций с использованием 0,5 до 12 микрограммов плазмиды в дозе. Подготовь соответствующий объем мастер-микса для количества рыбы в группе.Поместите капиллярную иглу на липкую сторону куска ленты на соответствующий держатель. Далее, пипетки капли плазмидных доз на кусок лабораторной пленки. После этого используйте наконечник нагрузки для переноса плазмидных капель из пленки в иглу.Пипетт медленно и осторожно, чтобы избежать трубчатых пузырьков воздуха в иглу. Распоистить микро-манипулятор и источник света. Затем переключитесь на кран давления воздуха в открытое положение.На передней панели микроинжектора отрегулируйте длину импульса до 10 секунд, используя режим времени. Затем настройте длину пульса с помощью 10-поворотного циферблата. Затем установите иглу на микро-пипетки держателя микро-манипулятора.Используйте пинцет, чтобы вырезать кончик иглы, чтобы жидкость была выталкивается, и использовать микроскоп для оценки положения иглы. Нажмите на пульт дистанционного переключения ног один раз, чтобы убедиться, что один второй импульс толкает небольшую каплю из иглы. Затем отрегулируйте настройки электропоратора и соедините пинцет с электропоратором.Чтобы держать рыбу в фиксированном положении во время инъекции использовать кусок губки с пазом вырезать в середине, как обивка. Тщательно замочите губку в системной воде и установите ее в чашку Петри. Используя пластиковую ложку, перенесите обезболированной зебры на влажную губку с вентральной стороной рыбы вниз в паз.Под микроскопом поместите иглу под углом 45 градусов близко к спинной мышце зебры, а затем найти небольшое пятно без чешуи перед спинным плавником и нажмите иглу в мышцу. Если какой-либо сопротивления ощущается попробовать соседнее место. Используйте переключатель стопы, чтобы постепенно вводить плазмидный раствор в мышцу.Под микроскопом фенол красный должен быть виден, как он входит в мышечную ткань. Электропорат рыбы сразу после инъекции, поместив пинцет типа электродов на каждой стороне места инъекции. Нажмите кнопку запуска на электропоратор и дайте ему шесть 40-вольтовых 50 миллисекундных импульсов.Затем аккуратно перенесите рыбу в восстановительный резервуар. Наконец, после анаэтизации рыбы в соответствии с текстовым протоколом, используйте ультрафиолетовый свет, чтобы увидеть выражение EGFP рядом с местом инъекции. В этом протоколе антигены ДНК были клонированы рядом с GFP в векторе экспрессии.Зебрафиш были введены с ДНК антиген плазмиды внутримышечно с микро инжектором, и место инъекции было электропотери для улучшения потребления плазмидов в клетки. Для визуализации выражение антигена можно визуализировать с помощью микроскопии флуоресценции. В этом случае вблизи места инъекции было обнаружено выражение всех трех белков синтеза антигена GFP, хотя их интенсивность была различной.Через пять недель после иммунизации микобактериальными антигенами зебры были инфицированы микобактериями маринума. ДЛЯ определения бактериального бремени у каждой рыбы через четыре недели после инфицирования использовался ПЦКР. По сравнению с контрольной группой, рыба, иммунизированная антигеном, показала снижение бактериальных нагрузок после заражения М.маринумом.При выполнении этого метода важно тщательно спроектировать плазмидную конструкцию, проверить экспрессию антигена и практиковать технику инъекций перед масштабными экспериментами. Этот метод может проложить путь для экономически эффективного доклинического скрининга новых ДНК-кандидатов вакцины у взрослых зебры. Не забывайте, что благополучие животных очень важно, и правильная анестезия имеет важное значение при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Кожный лейшманиоз в спинной Кожа Хомяков: Полезная модель для скрининга Antileishmanial наркотикам

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Рассматривая роль носоглотки связанных лимфоретикулярных тканей (NALT) в мышь Ответы на вакцины

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Новый метод скрининга для направленной эволюции термостабильных ферментов Бактериолитические

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Комплексное 4D визуализация<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Инфекции у мышей

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Нормальных и злокачественных клетках мышц трансплантации в иммунной скомпрометированных взрослых данио рерио

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...