Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Anna Binaschi, Paolo Roncon og Eleonora Palma for deres bidrag til manuskripter udgivet i forrang.

Alle eksperimentelle procedurer er blevet godkendt af universitetet i Ferrara institutionelle Animal Care og brug udvalget og af det italienske sundhedsministerium (tilladelse: D.M. 246/2012-B) i overensstemmelse med retningslinjerne i de Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24 November 1986 (86/609/EØF). Denne protokol er specielt tilpasset glutamat og aspartat bestemmelse i rat brain dialysates opnået under EEG kontrol af mikrodalyse sessioner i epileptiske og ikke-epileptiske rotter. Mange af de materialer...

I dette arbejde viser vi, hvordan en kontinuerlig video-EEG registrering kombineret med mikrodalyse kan udføres i en eksperimentel model af FLE. Video-EEG optagelse teknikker bruges til at korrekt diagnosticere de forskellige faser af sygdomsprogression i dyr og mikrodalyse teknik bruges til at beskrive de ændringer i glutamat udgivelse, der forekommer i tid (ingen ændringer er blevet fundet for aspartat i en tidligere offentliggjort undersøgelse2). Vi anbefaler brugen af en enkelt enhed/impla...

For at give indsigt i den funktionelle svækkelse af glutamat-medieret excitatoriske og GABAergic hæmmende neurotransmission resulterer i spontane anfald i FLE (TLE) har overvåges vi systematisk ekstracellulære koncentrationer af GABA1 og senere niveauer af glutamat og aspartat2 af mikrodalyse i den ventrale hippocampus af rotter på forskellige tidspunkter af sygdommens naturlige kursus, dvs, i løbet af udvikling og progression af epilepsi. Vi tog fordel af TLE pilocarpin model i rotter, som efterligner sygdom meget præcist med hensyn til adfærdsmæssige, elektrofysiologiske og histopatologiske forandringer3,4 og vi korreleret dialysat koncentrationen af amino syrer til sine forskellige faser: den akutte fase efter den epileptogenic fornærmelse, latency fase, tidspunktet for den første spontane anfald og kronisk phass5,6,7. Indramning sygdom faser blev aktiveret af video-EEG langtidsovervågning og præcise EEG og klinisk karakterisering af spontane anfald. Anvendelsen af mikrodalyse teknik forbundet med langsigtede video-EEG overvågning tilladt os at foreslå mekanistiske hypoteser for TLE neuropatologiske. I Resumé tillader teknikken beskrevet i dette håndskrift bindingen af neurokemiske forandringer inden for et defineret hjernen område med udvikling og progression af epilepsi i en dyremodel.
Forbundne enheder, der består af en dybde elektrode sammenstillet til en mikrodalyse kanyle, er ofte beskæftiget i epilepsi forskningsundersøgelser hvor ændringer i neurotransmittere, deres metabolitter eller energi substrater bør være korreleret til neuronal aktivitet. I langt de fleste tilfælde, det bruges i frit opfører dyr, men det også kan gennemføres på samme måde i mennesker, fxi farmako-resistente epileptiske patienter i dybde elektrode undersøgelse før kirurgi8. Både EEG registrering og dialysat samling kan udføres særskilt (f.eks.implantering elektrode i en halvkugle og mikrodalyse sonde i anden halvkugle eller selv udføre mikrodalyse i én gruppe af dyr, mens de udfører den eneste EEG i en anden gruppe af dyr). Dog kobling elektroder til sonder kan have flere fordele: det forenkler stereotaxisk kirurgi, begrænser vævsskader til kun én halvkugle (mens den anden intakt, som et kontrolelement for histologiske undersøgelser), og homogenizes resultater som disse er fremstillet af det samme område af hjernen og de samme dyr.
På den anden side kræver forberedelse af koblede mikrodalyse sonde-elektrode enhed færdigheder og tid, hvis det er hjemmelavet. Man kunne bruge relativt store mængder af penge, hvis købt fra markedet. Desuden, hvornår mikrodalyse sonder (sonde tips er typisk 200-400 µm i diameter og 7-12 mm lange)9og EEG elektroder (elektrode tips er normalt af 300-500 µm i diameter, og lang nok til at nå den hjerne struktur af interesse10) kombineret, repræsenterer de monterede enhed en pladskrævende og relativt tunge objekt på den ene side af hovedet, som er besværlige for dyr og tilbøjelige til at være tabt, især når det er tilsluttet til dialyse pumpen og hårdt-wire EEG optagelse system. Dette aspekt er mere relevante i epileptiske dyr, der er svære at håndtere og mindre adaptive til mikrodalyse sessioner. Korrekte kirurgiske teknikker og passende postoperativ pleje kan resultere i langvarig implantater, der forårsager minimal animalske ubehag og bør videreføres for combinatory mikrodalyse-EEG eksperimenter10,11, 12.
Fordele og begrænsninger af den mikrodalyse teknik er blevet behandlet i detaljer af mange neuroforskere. Dens primære fordel over andre i vivo perfusion teknikker (f.eks., hurtigt flow push-pull eller kortikale cup perfusion) er en lille diameter af sonden, der dækker et relativt præcise område af interesse13,14, 15. For det andet skaber den mikrodalyse membran en fysisk barriere mellem væv og perfusate; derfor høj Molekylær vægt stoffer krydse ikke og forstyrrer ikke analysen16,17. Desuden, væv er beskyttet fra turbulent strømning af perfusate18. En anden vigtig fordel er muligheden for at ændre perfusate strømmen for at maksimere analysandens koncentration i perfusate (dvs., processen med mikrodalyse godt kan defineres matematisk og kan ændres til at give høj koncentrationer af analysand i prøveopløsningen)19. Endelig, teknikken kan bruges til at indgyde stoffer eller restkoncentrationer af farmakologisk virksomme stoffer i væv af interesse og bestemme deres virkning i stedet for intervention20. På den anden side har mikrodalyse en begrænset løsningstid (typisk mere end 1 min på grund af den nødvendige tid til indsamling af prøver) i forhold til elektrokemisk eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknik, der forårsager vævsskader; Det bringer den neurokemiske balance i rummet omkring membran på grund af den fortsatte koncentration graduering af alle opløselige stoffer, der træder perfusate sammen med analysanden af interesse. Endelig, den mikrodalyse teknik er stærkt påvirket af grænserne for de analytiske teknikker anvendes til kvantificering af stoffer i perfusate9,21,22,23 . High-performance væskekromatografi (HPLC) efter forædling med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartat analyse i biologiske prøver er blevet godt valideret24,25,26 , 27 og dens omfattende diskussion er ikke omfattet af dette manuskript, men de data, der er produceret ved hjælp af denne metode vil blive beskrevet i detaljer.
Når udført korrekt og uden ændringer af perfusate sammensætning, kan mikrodalyse give pålidelige oplysninger om de basale niveauer af neurotransmitter frigivelse. Den største del af de basale niveauer er sandsynligvis et resultat af senderen afsmitning fra synapser9. Fordi i mange tilfælde enkel prøveudtagning af neurotransmitter i det ekstra synaptic rum ikke er tilstrækkelige til at forfølge målene i en undersøgelse, kan mikrodalyse teknik anvendes også, at stimulere neuroner eller at fratage dem vigtige fysiologiske ioner som K+ eller Ca2 +, at fremmane eller forhindre frigivelse af neurotransmitter.
Høj K+ stimulation er ofte brugt i neurobiologi for at stimulere neuronal aktivitet ikke blot i vågen dyr, men også i grundskolen og organotypic kulturer. Udsættelse af en sund centralnervesystemet til løsninger med høje koncentrationer af K+ (40-100 mM) fremkalder udstrømningen af neurotransmittere28. Denne evne af neuroner til at give en yderligere frigivelse i svar til høj K+ kan blive kompromitteret i epileptiske dyr1 og andre neurodegenerative sygdomme29,30. Ligeledes frigive Ca2 + afsavn (fremstillet ved perfusing Ca2 + gratis løsninger) bruges til at etablere calcium-afhængige af de fleste neurotransmittere målt ved mikrodalyse. Det menes generelt, Ca2 + afhængige frigivelse er af neuronal oprindelse, hvorimod Ca2 + selvstændig frigivelsen stammer fra glia, men mange undersøgelser rejst kontrovers over betydningen af Ca2 +-følsomme målinger af f.eks. glutamat eller GABA9: således, hvis det er muligt, er det tilrådeligt at støtte mikrodalyse undersøgelser med mikrosensorer undersøgelser, som sidstnævnte har højere spatial opløsning og elektroderne giver mulighed for at komme tættere på synapser31.
Vedrørende mikrodalyse undersøgelser i epileptiske dyr er det vigtigt at understrege, at oplysninger indhentet fra de fleste af dem afhængige af video eller video-EEG overvågning af anfald, dvs, forbigående forekomsten af tegn og/eller symptomer på grund af unormale overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen32. Der er noget specielt for electrographic anfald i pilocarpin behandlet dyr, som bør overvejes, når du forbereder eksperimentet. Spontane anfald efterfølges af deprimeret aktivitet med hyppige EEG interictal pigge3 og forekomme i klynger33,34. Forlorne drives ikke-epileptiske dyr kan udstille beslaglæggelse-lignende aktivitet35 og derfor parametre for EEG optagelser evaluering bør være standardiseret36 og, hvis det er muligt, timingen af mikrodalyse sessioner skal være veldefineret. Endelig, vi varmt anbefale følgende principper og metodologiske standarder for video-EEG overvågning i kontrol voksen gnavere skitseret af eksperter fra internationale liga mod epilepsi og amerikanske epilepsi samfund i deres meget nylige rapporterne37 ,38.
Her beskriver vi mikrodalyse af glutamat og aspartat parallelt med de langsigtede video-EEG optagelser i epileptiske dyr og deres analyse i den dialysat ved HPLC. Vi vil understrege de kritiske trin i den protokol, som man bør tage sig af for bedste resultat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Mikrodalyse er en veletableret neurovidenskab teknik, der korrelerer ændringer af neurologisk lægemiddelstoffer spreder ind i hjernen interstitielle rum med adfærd og/eller specifikke resultatet af en patologi (fx anfald for epilepsi). Når man studerer epilepsi, er den mikrodalyse teknik ofte kombineret med kortsigtede eller endda langsigtede video-electroencefalografi (EEG) overvågning for at vurdere spontane anfald hyppigheden, sværhedsgrad, progression og klyngedannelse. Den kombinerede mikrodalyse-EEG er baseret på brug af flere metoder og instrumenter. Her, udførte vi i vivo mikrodalyse og kontinuerlig video-EEG optagelse til skærm glutamat og aspartat udstrømning over tid, i forskellige faser af den naturlige historie af epilepsi i en rotte model. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for parring af ændringer i neurotransmitter frigivelse med bestemte faser af udvikling af sygdom og progression. Koncentrationen af aminosyren i den dialysat var bestemt af væskekromatografi. Her, vi beskrive metoder og skitsere de vigtigste forebyggende foranstaltninger man skal tage under i vivo mikrodalyse-EEG, med særlig vægt på de stereotaxisk kirurgi, basal og høj kalium stimulering under mikrodalyse, dybde elektrode EEG registrering og højtydende væskekromatografi analyse af aspartat og glutamat i den dialysat. Denne tilgang kan tilpasses til at teste forskellige stof eller sygdom induceret ændringer af de fysiologiske koncentrationer af aspartat og glutamat i hjernen. Afhængigt af tilgængeligheden af en passende analytisk assay, kan det yderligere bruges til at teste forskellige opløselige molekyler, når ansætte EEG optagelse på samme tid.

Sonden opsving
Den gennemsnitlige genfindelse (dvs. den gennemsnitlige aminosyre indhold i perfusate som en procentdel af indholdet i et lige saa stort volumen af hætteglasset løsning) var 15.49 ± 0,42% med en væskehastighed på 2 μl/min og 6,32 ± 0,64 3 μL/min. for glutamat og 14.89 ± 0,36% med en væskehastighed på 2 ΜL/min og 10.13 ± 0,51 3 μL/min. for aspartat når du bruger cuprophane membran sonde. Hvis ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Her, beskriver vi en metode til i vivo mikrodalyse til at analysere aspartat og glutamat udgivelse i den ventrale hippocampus epileptiske og ikke-epileptiske rotter i kombination med EEG optagelser. Ekstracellulære koncentrationer af aspartat og glutamat kan være korreleret med de forskellige faser af sygdommen.

Mikrodalyse af excitatoriske aminosyrer under EEG optagelser i frit flytte rotter

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i neurovidenskab såsom ændringer i neurokemi under den naturlige historie af neurologiske sygdomme. Den største fordel ved den foreslåede mikrodialyse EEG-teknik er, at en sådan kombineret tilgang gør det muligt at parre ændringer i neurotransmitterens frigivelse inden for specifikke stadier af sygdomsudvikling og progression. Begynd med at tænde forstærkeren placeret uden for Faraday Cage.Åbn EEG-softwaren, og start EEG-anskaffelsen, og overhold EEG-signalet fra kabler uden forbindelse. Dernæst forbinde dyret til tøjret EEG registreringssystem ved at holde dyrets hoved mellem to strakte fingre på den ene hånd og skrue ned stikkene til elektrode piedestal ved hjælp af den anden frie hånd. Indstil en forstærkningsfaktor på hver kanal i forstærkeren i henhold til elektrodesignalet fra et enkelt dyr, så EEG-signalet er i skala.Så lad dyret udforske det nye bur i mindst en time under direkte observation af forskeren. Juster kablet i henhold til dyrets vare, og sørg for, at kablerne ikke forstyrrer dyrets bevægelser og liggende kropsholdning. Endelig skal du kontrollere for det korrekte billede indramning på videokameraer og derefter starte videoen EEG optagelse.Begynd med at forberede mikrodialysesonderne til første brug i henhold til producentens brugervejledning og fyld dem med Ringers løsning. Derefter skæres 10 centimeter lange stykker FEP Slanger og forbinde dem til indløb og udløb kanyler af sonden ved hjælp af slange adaptere i forskellige farver. Sørg for, at slangen rører ved adapterne uden død plads i alle tilslutninger.Fjern dukkenylen fra dens guide ved hjælp af pincetten ved at holde dyrets hoved fast. Indsæt mikrodialysesonden i guidedylen og brug modelleringsler til yderligere at fast op i kanylen. Dernæst forbinde dyret til tøjret EEG registreringssystem.Sæt derefter dyret ind i plexiglas cylinder og lad det udforske det nye miljø. Følg de vågne og frit bevægende rottebevægelser. Derefter tilsluttes sondens indløb til 2,5 millilitersprøjten med en stump 22 gauge nål, der indeholder Ringes opløsning ved hjælp af slangeadapterne.Skub en milliliter Ringers opløsning ind i sonden på 10 sekunder ved at trykke stemplet på 2,5 millilitersprøjten kontinuerligt. Kontroller, om væsken er på stikkontakten, når sonden er klar til brug. Til sidst skal du fylde de 2,5 millilitersprøjter, der er tilsluttet FEP-slangerne med slangeadaptere med Ringers løsning, og montere dem på infusionspumpen.Start pumpen på to mikroliter i minuttet og lad den køre natten over. Efter at have kontrolleret via video EEG optagelser fraværet af anfald i de tre timer forud for prøvetagningen, skal du stoppe pumpen med FEP-slangekanyolerede sprøjter fyldt op med Ringers løsning. Monter et andet sæt 2,5 millilitersprøjter, der er tilsluttet FEP-slanger med slangeadaptere fyldt op med en modificeret Ringeopløsning indeholdende 100 millimolar kaliumopløsning.Start pumpen på to mikroliter i minuttet og lad den køre. Kontroller, at der ikke er luftbobler i systemet, og sørg for, at slangen rører ved adapterne uden død plads i alle tilslutninger. Kontroller derefter, om væsken er på stikkontakten, når sonden er klar til brug.Tilslut derefter FEP-slangen af sprøjter fyldt op med Ringers opløsning til sondens indløbskanyle i hvert dyr og vent på væskefaldets udseende på spidsen af udløbet. Sondens udløb forbindes med FEP-slangen, som fører til opsamling i reagensglasset. Sæt FEP-slangen i det lukkede 0,2 milliliteragsglas med en perforeret hætte, og sørg for, at røret forbliver på plads ved at fastgøre det med et stykke modeller.Efter at have kørt pumpen ved to mikroliter i minuttet i 60 minutter uden at indsamle prøver for at ekvilibre systemet, indsamle fem på hinanden følgende 30 minutter dialysatprøver under baseline betingelser, og gemme prøver på is. Efter 10 minutter skal slangen skiftes fra sprøjterne med 100 millimolar kaliumringens opløsning til normal Ringes Opløsning, og lad pumpen køre. Efter indsamling af den femte post-equilibration dialysat, indsamles 20 mikroliter dialysat fraktioner hver 10 minutter i en time.Derefter indsamles yderligere tre 30 minutter dialysatprøver og stoppe pumpen. Endelig opbevares prøverne på minus 80 grader Celsius efter forsøget, indtil HPLC-analysen. Når forsøget er afsluttet, skylles de anvendte mikrodialysesonder med destilleret vand, og de opbevares i et hætteglas fyldt med rent destilleret vand indtil næste brug.Endelig skylles hele mikrodialyseopsætningen med destilleret vand efterfulgt af 70 % ethanol. Udskift ethanol med luft, og opbevar opsætningen i et sterilt miljø. Disse er de repræsentative EEG spor registreret fra hippocampus af kontrol og epileptiske rotter i den kroniske fase af sygdommen.Ingen EEG ændring blev observeret i kontrol rotter, mens en synkroniseret paroxysmal epileptiform aktivitet blev observeret omkring 500 millisekunder før og under adfærdsmæssige anfald i epileptiske rotter. Basal glutamat koncentration fundet i kroniske epileptiske rotter var betydeligt højere end i kontrol dyr. Høj kalium fremkaldte en yderligere frigivelse af glutamat i ca 30 minutter i kontrol rotter og for omkring 60 minutter i kroniske epileptiske rotter.Under forsøget på denne procedure, er det vigtigt at huske, at dyr implanteret med enheden er tilbøjelige til at miste det i løbet af langvarigforsøg, så brug en lys hoved sæt og tilstrækkeligt lange kabler til at undgå at forstyrre dyrs mobilitet. Afhængigt af tilgængeligheden af en passende analytisk essay, kan metoden yderligere anvendes til at teste forskellige opløselige molekyler i hjernen, når der anvendes EEG optagelse på samme tid. Efter sin udvikling, denne teknik tillod forskerne inden for epileptology at give et indblik i ændringerne i excitatoriske neurotransmission i tilfælde af en tidsmæssig lap epilepsi.Efter at have set denne video, vi har tillid til du vil have en bedre forståelse af, hvordan man udfører in vivo mikrodialyse sammen med dybde elektrode EEG optagelse i en frit bevægende epileptisk rotte.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Hippocampale Insulin Mikroinjektion og<em&gt; In vivo</em&gt; Mikrodialyse Under Spatial Memory Test

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Optagelse af EEG i frit bevægende neonatale rotter ved hjælp af en ny metode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Samtidige optagelser af kortikale lokale felt potentialer, elektrokardiogram, Electromyogram og vejrtrækning rytmen fra en frit bevægende rotte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Noninvasiv EEG optagelser fra frit flytte smågrise

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Multi fiber fotometri til registrering af neurale aktiviteter i frit bevægende dyr

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

Intracerebroventrikulær levering af tarmafledte mikrobielle metabolitter i frit bevægelige mus

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

Extracellular Electrophysiological Recording in the Motor Cortex of Mice

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

Advancements in Multichannel Extracellular Recording for Studying Neuronal Activity in Freely Moving Mice (Video) | JoVE

Multikanals ekstracellulær optagelse i frit bevægelige mus

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...

Cerebrospinal Fluid and Blood Withdrawal from Rats with Concurrent EEG Recording

Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings

Obtaining High-Quality CSF and Blood Samples for Epilepsy Biomarker Discovery (Video) | JoVE

Prøveudtagning af cerebrospinalvæske og blod fra lateral halevene hos rotter under EEG-optagelser

Because the composition of body fluids reflects many physiological and pathological dynamics, biological liquid samples are commonly obtained in many ...

Multilayer Imaging with Microprism in Head-Fixed and Freely Moving Animals

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

Author Spotlight: Comparative Imaging of Neural Activity in Awake and Freely Moving States

Langsigtet billeddannelse af identificerede neurale populationer ved hjælp af mikroprismer i frit bevægelige og hovedfikserede dyr

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...