Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

De auteurs bedank Anna Binaschi, Paolo Roncon en Eleonora Palma voor hun bijdrage aan manuscripten gepubliceerd in voorrang.

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Ferrara institutionele Animal Care en gebruik Comité en door het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (vergunning: D.M. 246/2012-B) overeenkomstig de richtsnoeren in de EUROPESEGEMEENSCHAPPEN Richtlijn van de Raad van 24 November 1986 (86/609/EEG). Dit protocol is speciaal aangepast voor glutamaat en aspartaat bepaling in de rat hersenen dialysates verkregen onder controle van de EEG van microdialysis sessies bij epileptische en niet-epileptisc...

In dit werk, laten we zien hoe een ononderbroken video-EEG-registratie, in combinatie met microdialysis kan worden uitgevoerd in een experimenteel model van TLE. Video-EEG opname technieken worden gebruikt voor de verschillende fasen van de progressie van de ziekte bij dieren correct te diagnosticeren en de microdialysis-techniek wordt gebruikt om te beschrijven van de veranderingen in glutamaat release die zich in de tijd voordoen (geen wijzigingen gevonden voor aspartaat in een eerder gepubliceerde studie<sup class="xr...

Als u wilt bieden inzicht in de functionele aantasting van glutamaat-gemedieerde excitatory en remmende transmissie GABAergic resulterend in spontane aanvallen in de temporale kwab epilepsie (TLE), we systematisch worden gecontroleerd extracellulair concentraties van GABA1 en later de niveaus van glutamaat en aspartaat2 door microdialysis in de ventrale hippocampus van ratten op verschillende tijdstippen van de natuurlijke ziekte cursus, dat wil zeggen, tijdens de ontwikkeling en de vooruitgang van epilepsie. We profiteerde van de TLE pilocarpine model bij ratten, die de ziekte zeer nauwkeurig op het gebied van gedrags-, elektrofysiologische en histopathologische veranderingen3,4 bootst en wij de dialysate concentratie van amino gecorreleerd zuren zijn verschillende fasen: de acute fase na de epileptogene belediging, de latentie fase, het moment van de eerste spontane inbeslagneming en de chronische phass5,6,7. Framing van de fasen van de ziekte werd ingeschakeld door op lange termijn video-EEG toezicht en de precieze EEG en klinische karakterisering van spontane aanvallen. Toepassing van de techniek van de microdialysis in verband met langdurige video-EEG toezicht stond ons voor te stellen van mechanistische hypothesen voor TLE Neuropathologie. Kortom, de techniek beschreven in dit manuscript maakt het mogelijk de koppeling van neurochemical wijzigingen binnen een gedefinieerde hersenen gebied met de ontwikkeling en de progressie van epilepsie in een dierlijk model.
Gepaarde apparaten, samengesteld uit een diepte-elektrode heb geplaatst naar een canule microdialysis zijn vaak werkzaam in epilepsie onderzoeken waar veranderingen in neurotransmitters, hun metabolieten of energie substraten moeten worden gecorreleerd aan Neuronale activiteit. In de overgrote meerderheid van de gevallen, het wordt gebruikt in de dieren vrij te gedragen, maar het kan ook op een vergelijkbare manier mensenhandel, bijvoorbeeldin farmaco-resistente epileptische patiënten die een diepgaand onderzoek van de elektrode voorafgaand aan chirurgie8kunnen worden uitgevoerd. Zowel EEG opname en dialysate collectie kan afzonderlijk worden uitgevoerd (bijvoorbeeldhet implanteren van de elektrode in een halfrond en de microdialysis sonde in het andere halfrond of zelfs de microdialysis uitvoeren in één groep van dieren tijdens het uitvoeren van de enige EEG in een andere groep van dieren). Koppelen van de elektroden aan sondes echter wellicht meerdere voordelen: het vereenvoudigt stereotaxic chirurgie, beperkt weefselschade slechts één halfrond (terwijl anderzijds, intact, als een besturingselement voor histologisch onderzoek), en de resultaten als dit homogenizes zijn verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen en hetzelfde dier.
Aan de andere kant, vereist de voorbereiding van de gekoppelde microdialysis sonde-elektrode apparaat vaardigheden en tijd als het zelfgemaakte. Men kan relatief hoge hoeveelheden geld uitgeven als gekocht uit de markt. Bovendien, wanneer microdialysis sondes (sonde tips zijn meestal 200-400 µm in diameter en 7-12 mm lang)9en EEG elektroden (elektrode tips zijn meestal van 300-500 µm in diameter, en lang genoeg om te bereiken de hersenstructuur van belang10) zijn het gemonteerde apparaat gekoppeld, en vertegenwoordigt een omvangrijk en relatief zwaar object aan één zijde van het hoofd, dat is lastig voor de dieren en gevoelig te worden verloren, met name wanneer deze is aangesloten op de pomp van de dialyse en de harde-draads EEG opnamesysteem. Dit aspect is meer relevant in epileptische dieren die zijn moeilijk te behandelen en minder aanpassen aan de microdialysis-sessies. Juiste chirurgische technieken en de juiste post-operatieve zorg kunnen resulteren in langdurige implantaten die minimale dier ongemak veroorzaken en moeten worden gestreefd naar voor combinatorische microdialysis-EEG10,11, experimenten 12.
De voordelen en beperkingen van de techniek van de microdialysis zijn in detail onderzocht door vele neurowetenschappers. Het primaire voordeel ten opzichte van andere in vivo perfusie technieken (bijvoorbeeld, snelle stroom push-pull of corticale cup perfusie) is een kleine diameter van de sonde die een betrekkelijk nauwkeurige van belang13,14oppervlakte, 15. Ten tweede, het microdialysis-membraan creëert een fysieke barrière tussen het weefsel en het perfusaat; Daarom, hoog-moleculair gewicht stoffen niet doen oversteken en interfereert niet met de analyse16,17. Bovendien, het weefsel is beschermd tegen de turbulente stroming van het perfusaat18. Een ander belangrijk voordeel is de mogelijkheid om te wijzigen de perfusaat stroom voor het maximaliseren van de concentratie van de analyt in het perfusaat (dat wil zeggen, het proces van microdialysis kan wiskundig goed worden gedefinieerd en kan worden aangepast voor hoog rendement concentraties van de analyt in het monster)19. Tenslotte kan de techniek gebruikt worden om de infusie van de drugs of de farmacologisch werkzame stoffen in het weefsel van belang te bepalen van hun effect op de site van interventie20en. Aan de andere kant, heeft microdialysis een beperkte resolutie tijd (meestal meer dan 1 min te wijten aan de tijd die nodig is voor het verzamelen van monsters) in vergelijking met elektrochemische of biologische sensoren; het is een invasieve techniek waardoor weefselschade; het compromissen de neurochemical evenwicht binnen de ruimte rond het membraan als gevolg van de continue helling van de concentratie van alle oplosbare stoffen die het perfusaat samen met de analyt van belang treedt. Tot slot, de microdialysis-techniek is sterk beïnvloed door de grenzen van de analytische technieken gebruikt voor de kwantificering van stoffen in het perfusaat9,21,22,23 . De krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) nadat de bewerking met orthophthaldialdehyde voor glutamaat en aspartaat analyse in biologische monsters is goed gevalideerde24,25,26 , 27 en haar uitgebreide discussie valt buiten het bereik van dit manuscript, maar de gegevens die zijn geproduceerd met behulp van deze methode zal in detail worden beschreven.
Wanneer uitgevoerd naar behoren en zonder wijziging van de samenstelling van het perfusaat, kan microdialysis bieden betrouwbare informatie over het basale niveau van de neurotransmitter release. Het grootste deel van het basale niveau is waarschijnlijk het gevolg van de zender-spill-over van de synapsen9. Omdat in veel gevallen de eenvoudige bemonstering van de neurotransmitter in de extra synaptic ruimte niet voldoende is om de doelstellingen van een onderzoek, kan de techniek van de microdialysis ook worden ingezet ter stimulering van neuronen of te ontnemen van belangrijke fysiologische ionen zoals K+ of Ca2 +, te roepen of te voorkomen van het vrijkomen van de neurotransmitter.
Hoge+ K-stimulatie wordt het vaak gebruikt in de neurobiologie ter stimulering van de neuronale activiteit niet alleen in wakker dieren, maar ook in culturen van primaire en organotypic. De blootstelling van een gezond zenuwstelsel aan oplossingen met hoge concentraties van K+ (40-100 mM) roept de efflux van neurotransmitters28. Dit vermogen van neuronen te bieden een extra release in reactie op de hoge K+ kan worden aangetast in epileptische dieren1 en in andere neurodegeneratieve ziekten29,30. Ook de Ca2 + ontbering (verkregen door zoogdierlevercellen Ca2 + gratis oplossingen) wordt gebruikt om de calcium-afhankelijke release van meeste neurotransmitters gemeten door microdialysis. Het is over het algemeen geloofd dat Ca2 + afhankelijke versie van neuronale oorsprong, overwegende dat Ca2 + onafhankelijke release is afkomstig uit glia, maar veel studies verhoogd controverse over de betekenis van Ca2 +-gevoelige metingen van bv glutamaat of GABA9: dus, indien mogelijk, het is raadzaam om steun microdialysis studies met microsensor studies, omdat deze laatste hogere ruimtelijke resolutie hebben en de elektroden toestaat om dichter bij synapsen31.
Over microdialysis onderzoeken bij epileptische dieren is het belangrijk te benadrukken dat de gegevens die zijn verkregen van de meeste van hen afhankelijk van video of video-EEG monitoring van vangsten, dat wil zeggen, van de voorbijgaande voorkomen van tekenen en/of symptomen als gevolg van abnormale overmatig of synchrone Neuronale activiteit in de hersenen-32. Er zijn enkele specifieke kenmerken van electrographic vangsten in pilocarpine behandelde dieren die bij de voorbereiding van het experiment moeten worden onderzocht. Spontane aanvallen worden gevolgd door depressief activiteit met frequente EEG the spikes3 en optreden in clusters33,34. Schijnvertoning bediende niet-epileptische dieren vertonen inbeslagneming-achtige activiteit35 en daarom de parameters voor EEG opnames evaluatie moeten gestandaardiseerde36 en, indien mogelijk, de timing van microdialysis sessies goed gedefinieerd moet worden. Ten slotte raden we na de beginselen en de methodologische standaarden voor video-EEG toezicht bij controle volwassen knaagdieren beschreven door deskundigen van de International League tegen epilepsie en American epilepsie Society in hun zeer recente verslagen37 ,,38.
Hier beschrijven we microdialysis van glutamaat en aspartaat parallel met de lange termijn video-EEG opnamen in epileptische dieren en hun analyse in de dialysate door HPLC. Wij zullen de kritische stappen van het protocol waarmee men voor het beste resultaat zorgen moet benadrukken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Microdialysis is een gevestigde neurowetenschappen techniek die correleert de veranderingen van neurologisch werkzame stoffen verspreiden in de interstitiële ruimte van de hersenen met het gedrag en/of de specifieke resultaten van een pathologie (bijvoorbeeld aanvallen voor epilepsie). Bij de studie van epilepsie, wordt de microdialysis-techniek vaak gecombineerd met korte of zelfs lange termijn video-elektro-encefalografie (EEG) toezicht om spontane inbeslagneming frequentie, Ernst, progressie en clustering te beoordelen. De gecombineerde microdialysis-EEG is gebaseerd op het gebruik van verschillende methoden en instrumenten. Hier, we uitgevoerd in vivo microdialysis en continue video-EEG opnemen op glutamaat en aspartaat uitstroom van de monitor na verloop van tijd in verschillende fasen van de natuurlijke geschiedenis van epilepsie in een rat-model. Deze gecombineerde aanpak maakt het mogelijk de koppeling van veranderingen in de release neurotransmitter met specifieke stadia van de ontwikkeling van de ziekte en de progressie. De concentratie van het aminozuur in de dialysate werd bepaald door vloeistofchromatografie. Hier beschrijven we de methoden en het overzicht van de belangrijkste bewarende maatregelen één tijdens in vivo microdialysis moet-EEG, met bijzondere aandacht voor de stereotaxic operatie, basale en hoge kalium stimulatie tijdens microdialysis, diepte elektrode EEG opname en krachtige vloeibare chromatografie analyse aspartaat of glutamaat in het dialysate. Deze aanpak kan worden aangepast voor het testen van een scala aan drugs of ziekte veroorzaakte wijzigingen van de fysiologische concentraties aspartaat of glutamaat in de hersenen. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een passende analytische bepaling, kan het verder worden gebruikt voor het testen van verschillende oplosbare moleculen als EEG opname tegelijkertijd in dienst.

Sonde herstel
De gemiddelde terugvinding (dat wil zeggen, de inhoud van de gemiddelde aminozuur in het perfusaat als een percentage van de inhoud in een gelijk volume van de oplossing van vial) was 15.49 ± 0,42% op een debiet van 2 l/min en 6.32 ± 0.64 op 3 l/min voor glutamaat en 14.89 ± 0.36% op een debiet van 2 L/min en 10.13 ± 0.51 op 3 l/min voor aspartaat bij het gebruik van de cuprophane membraan sonde. Als de ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen, zoals de veranderingen in de neurochemie tijdens de natuurlijke geschiedenis van neurologische ziekten. Het belangrijkste voordeel van de voorgestelde microdialyse EEG-techniek is dat een dergelijke gecombineerde aanpak het mogelijk maakt om veranderingen in de afgifte van neurotransmitter binnen specifieke stadia van de ziekteontwikkeling en -progressie te koppelen. Begin met het inschakelen van de versterker die buiten de Kooi van Faraday is geplaatst.Open de EEG-software en start de EEG-acquisitie en observeer het EEG-signaal dat wordt geproduceerd door niet-verbonden kabels. Sluit het dier vervolgens aan op het vastgebonden EEG-opnamesysteem door het hoofd van het dier tussen twee uitgerekte vingers van één hand te houden en de connectoren met de andere vrije hand naar de elektrode voetstuk te schroeven. Stel een versterkingsfactor in op elk kanaal van de versterker volgens het elektrodesignaal van een enkel dier, zodat het EEG-signaal op schaal is.Laat het dier vervolgens de nieuwe kooi minstens een uur verkennen onder de directe observatie van de onderzoeker. Pas de kabel aan op de goederen van het dier en zorg ervoor dat de kabels de bewegingen en de liggende houding van het dier niet verstoren. Controleer ten slotte op de juiste beeldinluiing op de videocamera's en start vervolgens de video-EEG-opname.Begin met het voorbereiden van de microdialyse sondes voor het eerste gebruik volgens de handleiding van de fabrikant gebruiker en vul ze met Ringer's Solution. Snijd vervolgens 10 centimeter lange stukken FEP-buizen en sluit ze aan op de inlaat- en uitlaatblikjes van de sonde met behulp van de buizenadapters van verschillende kleuren. Zorg ervoor dat de slang de adapters raakt zonder dode ruimte in alle aansluitingen.Verwijder de dummy canule uit de geleider met behulp van de pincet door het hoofd van het dier stevig vast te houden. Steek de microdialysesonde in de geleide canule en gebruik modelleringsklei om de canule verder te verstevigen. Sluit het dier vervolgens aan op het aangebonden EEG-opnamesysteem.Zet het dier vervolgens in de plexiglascilinder en laat het de nieuwe omgeving verkennen. Volg de wakkere en vrij bewegende rattenbewegingen. Sluit vervolgens de inlaat van de sonde aan op de 2,5 milliliter spuit met een afgestompte 22-meter naald met Ringer's Solution met behulp van de buizenadapters.Duw een milliliter van Ringer's Solution in de sonde in 10 seconden door het duwen van de zuiger van de 2,5 milliliter spuit continu. Controleer op de druppel van de vloeistof die op de uitlaat verschijnt om aan te geven wanneer de sonde klaar is voor gebruik. Tot slot, vul de 2,5 milliliter spuiten aangesloten op FEP buizen door buizen adapters met Ringer's Solution en monteer ze op de infuus pomp.Start de pomp op twee microliter per minuut en laat het 's nachts lopen. Na het verifiëren via video EEG-opnames de afwezigheid van aanvallen in de drie uur voorafgaand aan de monsterverzameling, stop de pomp met de FEP-buizen met ingeblikte spuiten gevuld met Ringer's Solution. Monteer een andere set van 2,5 milliliter spuiten aangesloten op FEP buizen met buizen adapters gevuld met een gemodificeerde Ringer's Solution met 100 millimolar kalium oplossing.Start de pomp op twee microliter per minuut en laat het lopen. Controleer op de afwezigheid van luchtbellen in het systeem en zorg ervoor dat de slang raakt de adapters zonder dode ruimte in alle aansluitingen. Controleer vervolgens op de druppel van de vloeistof die op de uitgang verschijnt om aan te geven wanneer de sonde klaar is voor gebruik.Sluit vervolgens de FEP-slang van spuiten gevuld met Ringer's Solution aan op de inlaat canule van de sonde in elk dier en wacht op het verschijnen van de vloeistofdruppel op de punt van de uitlaat. Sluit de uitlaat van de sonde aan op de FEP-slang die leidt tot verzameling in de reageerbuis. Steek de FEP-buizen in de gesloten 0,2 milliliter reageerbuis met een geperforeerde dop en zorg ervoor dat de buis op zijn plaats blijft door het te bevestigen met een stuk modelbouwklei.Na het uitvoeren van de pomp op twee microliters per minuut gedurende 60 minuten zonder het verzamelen van monsters om het systeem te equilibrate, verzamelen vijf opeenvolgende 30 minuten dialyseren monsters onder basislijn omstandigheden, en bewaar monsters op ijs. Na 10 minuten schakelt u de slang van de spuiten met 100 millimolar kalium Ringer's Solution naar de normale Ringer's Solution en laat u de pomp draaien. Na het verzamelen van het vijfde dialysaat na het evenwicht na het evenwicht, verzamel 20 microliter dialysaatfracties om de 10 minuten gedurende een uur.Verzamel vervolgens drie extra dialyseren monsters van 30 minuten en stop de pomp. Tot slot, bewaar de monsters op min 80 graden Celsius na het experiment tot HPLC analyse. Nadat het experiment is voltooid, spoel de gebruikte microdialysesondes met gedestilleerd water en bewaar ze in een flacon gevuld met schoon gedestilleerd water tot het volgende gebruik.Spoel ten slotte de volledige microdialyse-setup af met gedestilleerd water, gevolgd door 70 procent ethanol. Vervang ethanol door lucht en bewaar de installatie in een steriele omgeving. Dit zijn de representatieve EEG-sporen die zijn geregistreerd van de hippocampus van controle en epileptische ratten tijdens de chronische fase van de ziekte.Geen EEG wijziging werd waargenomen bij de bestrijding van ratten, terwijl een gesynchroniseerde paroxysmale epileptiforme activiteit werd waargenomen ongeveer 500 milliseconden voor en tijdens de gedragsaanvallen bij epileptische ratten. Basale glutamaatconcentratie bij chronische epileptische ratten was aanzienlijk hoger dan bij controledieren. Hoog kalium riep een extra afgifte van glutamaat voor ongeveer 30 minuten bij de bestrijding van ratten en voor ongeveer 60 minuten bij chronische epileptische ratten.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat dieren die met het apparaat zijn geïmplanteerd, geneigd zijn het te verliezen tijdens een langdurig experiment, dus gebruik een lichte kopset en voldoende lange kabels om te voorkomen dat ze de mobiliteit van dieren verstoren. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een geschikt analytisch essay, kan de methode verder worden gebruikt om verschillende oplosbare moleculen in de hersenen te testen wanneer het gebruik van EEG-opname op hetzelfde moment. Na de ontwikkeling ervan, deze techniek kon de onderzoekers op het gebied van epileptologie om inzicht te geven in de veranderingen in excitatory transmissie in het geval van een temporale kwab epilepsie.Na het bekijken van deze video, vertrouwen we erop dat u een beter begrip van hoe te presteren in vivo microdialyse samen met diepte elektrode EEG-opname in een vrij bewegende epileptische rat.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

High-density EEG-registraties van de vrij bewegende muizen met behulp van Polyimide op basis van micro-elektrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Insuline en hippocampale Microinjection<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialyse Tijdens ruimtelijk geheugen testen

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG opnemen bij vrij bewegende neonatale ratten met behulp van een nieuwe methode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gelijktijdige opnamen van corticale lokale veld Potentials, elektrocardiogram Electromyogram en ademhaling ritme van een vrij bewegende Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Noninvasive EEG opnamen vrij bewegen biggen

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Multi-Fiber fotometrie om neurale activiteit op te nemen in vrij bewegende dieren

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

Extracellular Electrophysiological Recording in the Motor Cortex of Mice

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

Advancements in Multichannel Extracellular Recording for Studying Neuronal Activity in Freely Moving Mice (Video) | JoVE

Meerkanaals extracellulaire opname in vrij bewegende muizen

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...

Cerebrospinal Fluid and Blood Withdrawal from Rats with Concurrent EEG Recording

Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings

Obtaining High-Quality CSF and Blood Samples for Epilepsy Biomarker Discovery (Video) | JoVE

Bemonstering van hersenvocht en bloed uit laterale staartader bij ratten tijdens EEG-opnames

Because the composition of body fluids reflects many physiological and pathological dynamics, biological liquid samples are commonly obtained in many ...

Multilayer Imaging with Microprism in Head-Fixed and Freely Moving Animals

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

Author Spotlight: Comparative Imaging of Neural Activity in Awake and Freely Moving States

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...