Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Die Autoren möchten Anna Binaschi, Paolo Roncon und Eleonora Palma für ihren Beitrag zur Manuskripte veröffentlicht in der Rangfolge bedanken.

Alle experimentelle Verfahren von der University of Ferrara institutionelle Animal Care and Use Committee und vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden (Autorisierung: d.m. 246/2012-B) im Einklang mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des 24. November 1986 (86/609/EWG). Dieses Protokoll ist speziell für Glutamat und Aspartat-Bestimmung in Ratte Gehirn Dialysates gemäß EEG Kontrolle der Mikrodialyse Sitzungen bei epileptischen und nicht-epileptischen Ratten erhaltenen angepasst...

In dieser Arbeit zeigen wir, wie eine kontinuierliche Video-EEG-Aufzeichnung gepaart mit Mikrodialyse in einem experimentellen Modell der TLE durchgeführt werden kann. Video-EEG-Aufzeichnung Techniken werden verwendet, um die verschiedenen Phasen der Fortschreiten der Krankheit bei Tieren korrekt zu diagnostizieren und die Mikrodialyse-Technik wird verwendet, um die Änderungen in Release Glutamat zu beschreiben, die rechtzeitig auftreten (keine Änderungen für wurden gefunden Aspartate in einer zuvor veröffentlichten...

Um Einblick in die Funktionsbeeinträchtigung der Glutamat-vermittelte exzitatorischen und GABAergen inhibitorischen Neurotransmission spontane Anfälle im Temporallappen-Epilepsie (TLE) wodurch überwacht wir systematisch extrazelluläre Konzentrationen von GABA1 und später die Ebenen von Glutamat und Aspartat-2 durch Mikrodialyse im ventralen Hippocampus von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten der natürlichen Krankheit Kurs, d.h.während der Entstehung und Progression von Epilepsie. Wir nutzten die TLE Pilocarpin Modell bei Ratten, das die Krankheit sehr genau in Bezug auf Verhalten, elektrophysiologische und histopathologische Veränderungen3,4 imitiert und wir korreliert die Dialysat Konzentration von amino Säuren, die verschiedenen Phasen: die akute Phase nach der epileptogenen Beleidigung, die Latenz-Phase, die Zeit der ersten spontanen Anfall und die chronische Phass5,6,7. Gestaltung der Phasen der Krankheit wurde durch Langzeit-Video-EEG-monitoring und die präzise EEG und klinische Charakterisierung von spontaner Anfälle ermöglicht. Anwendung der Mikrodialyse Technik im Zusammenhang mit Langzeit Video-EEG-monitoring erlaubt uns, mechanistische Hypothesen für TLE Neuropathologie vorzuschlagen. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht die Technik beschrieben in dieser Handschrift die Paarung von neurochemischen Veränderungen innerhalb einer definierten Gehirnregion mit der Entstehung und Progression von Epilepsie im Tiermodell.
Gekoppelte Geräte, bestehend aus einer Tiefe Elektrode an eine Kanüle Mikrodialyse gegenübergestellt werden oft an Epilepsie Forschungsstudien eingesetzt wo Veränderungen der Neurotransmitter, ihrer Metaboliten oder Energie-Substrate mit neuronaler Aktivität korreliert werden sollte. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle es ist in frei Verhalten Tiere verwendet, aber es kann auch in ähnlicher Weise in den Menschen, z. B.bei Pharmaco-resistente epileptischen Patienten Tiefe Elektrode Untersuchung vor der Operation8durchgeführt werden. EEG-Aufzeichnung sowohl Dialysat Sammlung kann separat durchgeführt werden (z. B.Implantation der Elektrode in einer Hemisphäre und der Mikrodialyse Sonden in die andere Hemisphäre oder sogar der Mikrodialyse in einer Gruppe von Tieren während der Durchführung das alleinige EEG in eine andere Gruppe von Tieren). Kopplung der Elektroden, Sonden müssen jedoch mehrere Vorteile: es vereinfacht stereotaktischen Chirurgie, Gewebeschäden, nur eine Hemisphäre beschränkt (wobei andererseits intakt, wie ein Steuerelement für histologische Untersuchungen), und die Ergebnisse wie diese homogenisiert ergeben sich aus der gleichen Region des Gehirns und das gleiche Tier.
Auf der anderen Seite erfordert die Vorbereitung des gekoppelten Mikrodialyse Sonde Elektrode Geräts Fähigkeiten und Zeit wenn es hausgemacht ist. Man konnte relativ hohe Mengen an Geld ausgeben, wenn vom Markt gekauft. Darüber hinaus Wenn Mikrodialyse Sonden (Prüfspitzen sind in der Regel 200-400 µm im Durchmesser und 7 bis 12 mm lang) sind9und EEG-Elektroden (Elektrodenspitzen sind in der Regel von 300-500 µm im Durchmesser, und lang genug um die Gehirnstruktur von Interesse10zu erreichen) gekoppelt, stellt das montierte Gerät ein sperriges und relativ schweres Objekt auf einer Seite des Kopfes, die ist für Tiere lästig und fehleranfällig, verloren zu werden, vor allem, wenn es an die Dialyse-Pumpe und die harten Draht EEG Recording-System angeschlossen ist. Dieser Aspekt ist in epileptische Tiere, die schwierig zu handhaben und weniger anpassungsfähig an die Mikrodialyse-Sitzungen sind relevanter. Richtige Operationstechniken und angemessene Nachsorge können dauerhafte Implantate, die minimale Tier Unbehagen verursachen und sollte verfolgt werden, für kombinatorische Mikrodialyse-EEG10,11, Experimente führen 12.
Die Vorzüge und Grenzen der Mikrodialyse Technik wurden durch viele Neurowissenschaftler im Detail überprüft. Der primäre Vorteil gegenüber anderen in Vivo Perfusion Techniken (z.B., Push-Pull-schnelle Strömung oder kortikale Tasse Perfusion) ist eine kleine Durchmesser der Sonde, die eine relativ genaue Fläche von Interesse13,14, 15. Zweitens schafft die Mikrodialyse Membran eine physische Barriere zwischen dem Gewebe und dem Perfusat; Daher hochmolekularen Gewicht Substanzen nicht überqueren und nicht stören die Analyse16,17. Darüber hinaus wird das Gewebe von der turbulenten Strömung Perfusat18geschützt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit, Perfusat Fluss zur Maximierung der Analyt-Konzentration in der Perfusat ändern (d. h., der Prozess der Mikrodialyse können mathematisch wohldefinierte und können geändert werden, um hohe Ausbeute Konzentration des Analyten in der Probe)19. Schließlich kann die Technik, Drogen oder pharmakologisch wirksamer Substanzen in das Gewebe von Interesse zu ziehen und ihre Wirkung am Ort der Intervention20bestimmen verwendet werden. Auf der anderen Seite hat Mikrodialyse zeitlich begrenzte Auflösung (in der Regel mehr als 1 min aufgrund des Zeitaufwands für Probenahmen) im Vergleich zu elektrochemischen oder biologischen Sensoren; Es ist eine invasive Technik, die Gewebeschäden verursacht; Es beeinträchtigt die neurochemische Gleichgewicht in den Raum um die Membran durch die kontinuierliche Konzentration Steigung von allen löslichen Substanzen tritt die Perfusat zusammen mit den Analyten von Interesse. Zu guter Letzt ist die Mikrodialyse-Technik stark beeinflusst durch die Grenzen der analytischen Techniken für die Quantifizierung von Substanzen im Perfusat9,21,22,23 . Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung mit Orthophthaldialdehyde für Glutamat und Aspartat-Analyse in biologischen Proben gut validierte24,25,26 wurde , 27 und seine umfangreiche Diskussion ist außerhalb des Bereichs dieser Handschrift, aber die Daten, die mit dieser Methode werden im Detail beschrieben werden.
Wenn richtig und ohne Änderungen der Zusammensetzung Perfusat durchgeführt, bieten Mikrodialyse verlässlichen Informationen über den basalen Ebenen der Freisetzung von Neurotransmittern. Der größte Teil der basalen Ebenen ist wahrscheinlich das Ergebnis Sender Spillover aus den Synapsen-9. Da die einfache Probenahme des Neurotransmitters im extra synaptischen Raum in vielen Fällen nicht ausreichen, um die Ziele einer Untersuchung zu verfolgen ist, kann die Mikrodialyse-Technik auch Neuronen stimulieren oder für sie wichtige berauben eingesetzt werden physiologischen Ionen wie K+ oder Ca2 +, um hervorrufen oder verhindern die Freisetzung des Neurotransmitters.
Hohe K+ -Stimulation ist oft in Neurobiologie zur neuronalen Aktivität nicht nur wach Tiere, sondern auch in Grund- und organotypischen Kulturen zu fördern. Die Belichtung ein gesundes zentrales Nervensystem zu Lösungen mit hohen Konzentrationen von K+ (40-100 mM) erinnert an die Fluth von Neurotransmittern28. Diese Fähigkeit von Nervenzellen, eine zusätzliche Freisetzung als Reaktion auf hohe K+ möglicherweise epileptische Tiere1 und in anderen neurodegenerativen Krankheiten29,30gefährdet. Ebenso die Ca2 + Entzug (durch Vorrichtung Ca2 + kostenlose Lösungen erhalten) verwendet wird, um Kalzium-abhängige zu etablieren-release von die meisten Neurotransmitter Mikrodialyse gemessen. Es wird allgemein angenommen, dass Ca2 + abhängige Release neuronalen Ursprungs, während Ca2 + unabhängige Freisetzung aus Glia stammt, aber viele Studien Kontroverse über die Bedeutung von Ca2 hoben +-empfindliche Messungen von z.B. Glutamat oder GABA9: also, wenn möglich, es empfiehlt sich, Mikrodialyse Studien mit Reinstraum Studien zu unterstützen, da diese letztere haben eine höhere räumliche Auflösung und die Elektroden näher an Synapsen31.
Bei epileptischen Mikrodialyse Tierstudien ist es wichtig zu betonen, dass die meisten von ihnen gewonnenen Daten verlassen sich auf video oder Video-EEG Überwachung der Anfälle, d. h., das vorübergehende Auftreten von Anzeichen oder Symptome durch abnorme übermäßige oder synchrone neuronaler Aktivität im Gehirn32. Es gibt einige Besonderheiten der elektrographischen Anfälle bei Tieren Pilocarpin behandelt, die berücksichtigt werden sollten, wenn Sie das Experiment vorbereiten. Spontane Anfälle treten in Clustern33,34und deprimiert Tätigkeit mit häufigen EEG korreliert Spitzen3 folgt. Schein operierten nicht-epileptische Tiere Beschlagnahme-ähnliche Aktivität35 aufweisen können sollte und daher die Parameter für EEG-Aufnahmen Bewertung standardisierte36 und, wenn möglich, sollte das Timing der Mikrodialyse Sitzungen gut definiert werden. Zu guter Letzt empfehlen wir nach den Prinzipien und methodische Standards zur Video-EEG Überwachung bei Erwachsenen Nagetieren Kontrolle von Experten der internationalen Liga gegen Epilepsie und amerikanischen Epilepsie Gesellschaft in ihren jüngsten Berichten37 beschrieben. ,38.
Hier beschreiben wir Mikrodialyse Glutamat und Aspartat-parallel mit der langfristigen Video-EEG-Ableitungen epileptische Tiere und deren Analyse in das Dialysat durch HPLC. Wir werden die entscheidenden Schritte des Protokolls zu betonen, die man für das beste Ergebnis kümmern sollte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Mikrodialyse ist eine gut etablierte Neurowissenschaften-Technik, die die Veränderungen der neurologisch Wirkstoffe diffundieren in das Gehirn zwischenräumlichen Raum mit dem Verhalten und/oder mit das konkrete Ergebnis der Pathologie (z. B. Anfälle korreliert für Epilepsie). Bei Epilepsie zu studieren, ist die Mikrodialyse-Technik oft mit kurzfristige oder auch langfristige Video-Elektroenzephalographie (EEG Überwachung zur Beurteilung von spontanen Anfall Frequenz, Schweregrad, Verlauf und clustering) kombiniert. Das kombinierte Mikrodialyse-EEG basiert auf der Verwendung von mehreren Methoden und Instrumenten. Hier führten wir in Vivo Mikrodialyse und kontinuierlichen Video-EEG-Aufzeichnung auf Monitor Glutamat und Aspartat-Abfluss im Laufe der Zeit in verschiedenen Phasen des natürlichen Verlaufs der Epilepsie in einem Rattenmodell. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht es, die Paarung von Änderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung mit bestimmten Phasen der Krankheitsentwicklung und Fortschreiten. Die Aminosäure-Konzentration in das Dialysat wurde durch flüssige Chromatographie bestimmt. Hier beschreiben wir die Methoden und die Gliederung der wichtigsten eins während in Vivo Mikrodialyse Vorsichtsmaßnahmen sollten-EEG, mit besonderem Augenmerk auf der stereotaktischen Operation, basale und hohe Kalium Stimulation während der Mikrodialyse, Tiefe Elektrode EEG-Aufzeichnung und Analyse der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Aspartat-und Glutamat in das Dialysat. Dieser Ansatz kann angepasst werden, eine Vielzahl von Drogen oder Krankheit testen induzierte Veränderungen der physiologischen Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat im Gehirn. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assay kann es weiter verwendet werden, verschiedene lösliche Moleküle zu testen, bei der EEG-Aufzeichnung zur gleichen Zeit beschäftigen.

Sonde Erholung
Die mittlere Erholung (d. h. die mittlere Aminosäuregehalt im Perfusat als Prozentsatz des Inhalts in ein gleiches Volumen der Durchstechflasche Lösung) war 15,49 ± 0,42 % bei einer Durchflussmenge von 2 μl/min und 6,32 ± 0,64 bei 3 μl/min für Glutamat und 14.89 ± 0,36 % bei einer Durchflussmenge von 2 Μl/min und 10,13 ± 0,51 bei 3 μl/min für Aspartate bei Verwendung der Cuprophane-Membran-Sonde...

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Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Hier beschreiben wir eine Methode zur in Vivo Mikrodialyse Aspartat- und Glutamat Freisetzung im ventralen Hippocampus von epileptischen und nicht-epileptischen Ratten, in Kombination mit EEG-Ableitungen zu analysieren. Extrazelluläre Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat können mit den verschiedenen Phasen der Erkrankung korreliert werden.

Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten, wie die Veränderungen in der Neurochemie während der Naturgeschichte von neurologischen Erkrankungen. Der Hauptvorteil der vorgeschlagenen Mikrodialyse-EEG-Technik ist, dass ein solcher kombinierter Ansatz die Paarung von Veränderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung innerhalb bestimmter Stadien der Krankheitsentwicklung und -progression ermöglicht. Beginnen Sie, indem Sie den Verstärker außerhalb des Faraday-Käfigs einschalten.Öffnen Sie die EEG-Software und starten Sie die EEG-Erfassung und beobachten Sie das EEG-Signal, das durch nicht angeschlossene Kabel erzeugt wird. Als nächstes verbinden Sie das Tier mit dem gefesselten EEG-Aufzeichnungssystem, indem Sie den Kopf des Tieres zwischen zwei gestreckten Fingern einer Hand halten und die Anschlüsse mit der anderen freien Hand an den Elektrodensockel schrauben. Stellen Sie auf jedem Kanal des Verstärkers einen Verstärkungsfaktor entsprechend dem Elektrodensignal eines einzelnen Tieres ein, damit das EEG-Signal skaliert wird.Dann lassen Sie das Tier den neuen Käfig für mindestens eine Stunde unter der direkten Beobachtung des Forschers erkunden. Passen Sie das Kabel entsprechend der Ware des Tieres an, und stellen Sie sicher, dass die Kabel die Bewegungen und die Liegehaltung des Tieres nicht stören. Überprüfen Sie schließlich die richtige Bildgestaltung auf den Videokameras, und starten Sie dann die Video-EEG-Aufnahme.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikrodialyse-Sonden für den ersten Einsatz gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers und füllen Sie sie mit Ringer-Lösung. Schneiden Sie dann 10 Zentimeter lange Stücke von FEP-Schläuchen und schließen Sie sie mit den Ein- und Auslasskanülen der Sonde mit den Schlauchadaptern in verschiedenen Farben an. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche die Adapter ohne Totraum in allen Verbindungen berühren.Entfernen Sie die Dummy-Kanüle aus ihrer Führungslinie mit der Pinzette, indem Sie den Kopf des Tieres fest halten. Setzen Sie die Mikrodialysesonde in die Führungskanüle ein und verwenden Sie Modellierton, um die Kanüle weiter zu festieren. Verbinden Sie das Tier anschließend mit dem angeschlossenen EEG-Aufzeichnungssystem.Dann legen Sie das Tier in den Plexiglaszylinder und lassen Sie es die neue Umgebung erkunden. Folgen Sie den wachen und frei beweglichen Rattenbewegungen. Verbinden Sie dann den Einlass der Sonde mit einer abgestumpften 22-Spur-Nadel mit Ringer-Lösung mit den Schlauchadaptern an die 2,5-Milliliter-Spritze.Schieben Sie einen Milliliter Ringer-Lösung in 10 Sekunden in die Sonde, indem Sie den Kolben der 2,5-Milliliter-Spritze kontinuierlich drücken. Prüfen Sie, ob der Tropfen der Flüssigkeit, der am Auslass erscheint, angezeigt wird, um zu bedeuten, wann die Sonde einsatzbereit ist. Schließlich füllen Sie die 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, durch Schlauchadapter mit Ringer-Lösung auf und montieren Sie sie auf die Infusionspumpe.Starten Sie die Pumpe mit zwei Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie über Nacht laufen. Nachdem eEG per Video bestätigt hat, dass in der drei stündigen Probenentnahme keine Anfälle vorhanden sind, stoppen Sie die Pumpe, die die mit Ringers Lösung gefüllten FEP-Schlauchdosenträgt. Montieren Sie einen weiteren Satz von 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, mit Schlauchadaptern, die mit einer modifizierten Ringer-Lösung gefüllt sind, die 100 Millimolar-Kaliumlösung enthält.Starten Sie die Pumpe mit zwei Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie laufen. Prüfen Sie, ob keine Luftblasen im System vorhanden sind, und stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter ohne Totraum in allen Anschlüssen berührt. Überprüfen Sie dann, ob der Tropfen der Flüssigkeit am Auslass erscheint, um zu begründen, wann die Sonde einsatzbereit ist.Als nächstes verbinden Sie die FEP-Schläuche von Spritzen, die mit Ringers Lösung gefüllt sind, mit der Einlaufkanüle der Sonde in jedem Tier und warten Sie auf das Auftreten des Flüssigkeitstropfens an der Spitze des Auslasses. Schließen Sie den Auslass der Sonde an den FEP-Schlauch an, der zur Entnahme im Reagenzglas führt. Setzen Sie den FEP-Schlauch mit einer perforierten Kappe in das geschlossene 0,2-Milliliter-Reagenzglas ein und sorgen Sie dafür, dass das Rohr durch Fixieren mit einem Stück Modellierton an Ort und Stelle bleibt.Nachdem Sie die Pumpe 60 Minuten lang mit zwei Mikrolitern pro Minute laufen lassen, ohne Proben zu sammeln, um das System auszugrenzen, sammeln Sie fünf aufeinander folgende 30-minütige Dialysatproben unter Basisbedingungen und lagern Sie Proben auf Eis. Schalten Sie nach 10 Minuten die Schläuche aus den Spritzen mit 100 Millimolaren Kaliumringerlösung auf normale Ringerlösung um und lassen Sie die Pumpe laufen. Nach der Entnahme des fünften Dialysats nach dem Ausgleich 20 Mikroliter-Dialysatfraktionen alle 10 Minuten für eine Stunde sammeln.Dann sammeln Sie drei zusätzliche 30 Minuten Dialysatproben und stoppen Sie die Pumpe. Schließlich lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius nach dem Experiment bis zur HPLC-Analyse. Nach Abschluss des Experiments die verwendeten Mikrodialysesonden mit destilliertem Wasser abspülen und bis zum nächsten Gebrauch in einer mit sauberem destilliertem Wasser gefüllten Durchstechflasche aufbewahren.Schließlich spülen Sie die gesamte Mikrodialyse einrichtung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 70 Prozent Ethanol. Ersetzen Sie Ethanol durch Luft, und lagern Sie das Setup in einer sterilen Umgebung. Dabei handelt es sich um die repräsentativen EEG-Spuren, die während der chronischen Phase der Krankheit aus dem Hippocampus der Kontrolle und epileptischen Ratten aufgezeichnet wurden.Bei Kontrollratten wurde keine EEG-Veränderung beobachtet, während eine synchronisierte paroxysmale epiptiforme Aktivität etwa 500 Millisekunden vor und während der Verhaltensanfälle bei epileptischen Ratten beobachtet wurde. Die Basalglutamatkonzentration bei chronischen epileptischen Ratten war signifikant höher als bei Kontrolltieren. Hoher Kalium evozierte eine zusätzliche Freisetzung von Glutamat für etwa 30 Minuten bei Kontrollratten und für etwa 60 Minuten bei chronischen epileptischen Ratten.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Tiere, die mit dem Gerät implantiert werden, dazu neigen, es während eines längeren Experiments zu verlieren, also verwenden Sie einen leichten Kopfsatz und ausreichend lange Kabel, um die Mobilität der Tiere zu vermeiden. Je nach Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Aufsatzes kann die Methode weiter verwendet werden, um verschiedene lösliche Moleküle im Gehirn zu testen, wenn gleichzeitig EEG-Aufzeichnung verwendet wird. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epilepsie einen Einblick in die Veränderungen der exzitatorischen Neurotransmission im Falle einer zeitlichen Lappenepilepsie.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, vertrauen wir darauf, dass Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie eine in vivo Mikrodialyse zusammen mit der Tiefenelektrode EEG-Aufnahme in einer frei beweglichen epileptischen Ratte durchführen können.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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