Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Anna Binaschi, Paolo Roncon ed Eleonora Palma per il loro contributo ai manoscritti pubblicati in precedenza.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Università di Ferrara istituzionale Animal Care e uso Comitato e dal Ministero italiano della salute (autorizzazione: D.M. 246/2012-B) in conformità con le linee guida delineate nelle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Questo protocollo è specificamente regolato per la determinazione del glutammato e aspartato in dializzato di cervello di ratto ottenuti sotto controllo EEG delle sessioni di microdialisi in ratti epilett...

In questo lavoro, vi mostriamo come una registrazione video-EEG continua accoppiata con microdialisi può essere eseguita in un modello sperimentale di TLE. Vengono utilizzate tecniche di registrazione video-EEG per diagnosticare correttamente le diverse fasi di progressione della malattia negli animali e la tecnica della microdialisi è usata per descrivere i cambiamenti nel rilascio di glutammato che si verificano nel tempo (i cambiamenti non sono stati trovati per aspartato in un studio precedentemente pubblicato<sup ...

Per consentono di comprendere il danno funzionale di neurotrasmissione eccitatorio e GABAergic neurotrasmissione inibitoria conseguente crisi epilettiche spontanee nell'epilessia del lobo temporale (TLE), abbiamo monitorato sistematicamente concentrazioni extracellulari di GABA1 e successivamente i livelli di glutammato e aspartato2 mediante microdialisi nell'ippocampo ventrale dei ratti in vari momenti della malattia naturale corso, vale a dire, durante lo sviluppo e la progressione dell'epilessia. Abbiamo approfittato del modello Pilocarpina TLE in ratti, che imita la malattia con estrema precisione in termini di cambiamenti comportamentali, elettrofisiologici e istopatologico3,4 e abbiamo correlato la concentrazione del dializzato di aminoacidi acidi di sue diverse fasi: la fase acuta dopo l'insulto epilettogena, la fase di latenza, tempo del primo grippaggio spontaneo e la phass cronica5,6,7. Inquadrare le fasi di malattia è stato attivato dal controllo del video-EEG a lungo termine e preciso EEG e caratterizzazione clinica di crisi epilettiche spontanee. Applicazione della tecnica del microdialysis connesso con controllo video-EEG a lungo termine ci ha permesso di proporre ipotesi meccanicistiche per neuropatologia TLE. In sintesi, la tecnica descritta in questo manoscritto permette l'abbinamento delle alterazioni neurochimiche all'interno di un'area definita del cervello con lo sviluppo e la progressione dell'epilessia in un modello animale.
Dispositivi associati, costituiti da un elettrodo di profondità giustapposto a una cannula di microdialisi, sono spesso impiegati in studi di ricerca di epilessia dove cambiamenti in neurotrasmettitori, loro metaboliti o substrati di energia dovrebbero essere correlate all'attività neuronale. Nella maggior parte dei casi, viene utilizzato a comportarsi liberamente gli animali, ma può anche essere condotta in modo simile in esseri umani, per esempio, in pazienti epilettici farmaco-resistente in fase di indagine di elettrodo di profondità prima della chirurgia8. Registrazione EEG sia dializzato raccolta può essere eseguita separatamente (ad esempio, impiantare l'elettrodo in un emisfero e la microdialisi della sonda in altro emisfero o anche eseguendo il microdialysis in un gruppo di animali durante l'esecuzione il suola EEG in un altro gruppo di animali). Tuttavia, gli elettrodi di accoppiamento a sonde può avere molteplici vantaggi: esso semplifica la chirurgia stereotassica, limita il danno di tessuto a un solo emisfero (mentre l'altra, lasciando intatti, come un controllo per gli esami istologici) e omogeneizza i risultati come questi sono ottenuti dalla stessa regione del cervello e l'animale stesso.
D'altra parte, la preparazione del dispositivo accoppiato microdialysis sonda elettrodo richiede abilità e il tempo se è fatta in casa. Uno potrebbe spendere quantità relativamente elevate di denaro se acquistato dal mercato. Inoltre, quando la microdialisi sonde (punte della sonda sono in genere 200-400 µm di diametro e 7-12 mm di lunghezza) sono9e gli elettrodi EEG (elettrodi sono solitamente di 300-500 µm di diametro e abbastanza a lungo per raggiungere la struttura del cervello di interesse10) accoppiato, il dispositivo montato rappresenta un oggetto ingombrante e relativamente pesante su un lato della testa, che è fastidioso per gli animali e incline a essere perso specialmente quando è collegato alla pompa dialisi e il sistema di registrazione EEG di filo duro. Questo aspetto è più rilevante negli animali epilettici che sono difficili da gestire e meno adattivo per le sessioni di microdialysis. Tecniche chirurgiche adeguate e appropriate cure post-operatorie possono provocare gli impianti di lunga durata che causano disagio minimo animale e dovrebbero essere perseguiti per esperimenti di microdialisi combinatorio-EEG10,11, 12.
Vantaggi e limiti della tecnica microdialysis sono stati esaminati in dettaglio da molti neuroscienziati. Il suo vantaggio primario rispetto ad altre in vivo aspersione tecniche (ad es., flusso rapido push-pull o aspersione corticale tazza) è un piccolo diametro della sonda che copre una zona relativamente precisa di interesse13,14, 15. In secondo luogo, la membrana di microdialysis crea una barriera fisica tra il tessuto e il perfusato; Pertanto, sostanze di alto peso molecolare non attraversano e non interferire con le analisi16,17. Inoltre, il tessuto è protetta dal flusso turbolento del perfusato18. Un altro importante vantaggio è la possibilità di modificare il flusso di perfusato per massimizzare la concentrazione dell'analita nel perfusato (cioè, il processo di microdialysis può ben essere definito matematicamente e può essere modificato per alto rendimento concentrazione dell'analita nel campione)19. Infine, la tecnica può essere utilizzata per infondere i farmaci o sostanze farmacologicamente attive nel tessuto di interesse e determinare il loro effetto presso il sito di intervento20. D'altra parte, microdialisi ha un tempo di risoluzione limitata (in genere più di 1 min a causa del tempo necessario per la raccolta di campioni) rispetto ai sensori elettrochimici o biologici; è una tecnica invasiva che provoca danni ai tessuti; compromette l'equilibrio neurochimico all'interno dello spazio intorno alla membrana dovuto la pendenza di concentrazione continua di tutte le sostanze solubili che entra il perfusato insieme con l'analita di interesse. Infine, la tecnica della microdialisi è fortemente influenzata dai limiti delle tecniche analitiche utilizzate per la quantificazione di sostanze del perfusato9,21,22,23 . La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione con orthophthaldialdehyde per l'analisi di glutammato e aspartato in campioni biologici è stato convalidato ben24,25,26 , 27 e la sua vasta discussione è fuori della portata di questo manoscritto, ma i dati prodotti con questo metodo verranno descritti in dettaglio.
Quando eseguita correttamente e senza modifiche della composizione di perfusato, microdialisi è in grado di fornire informazioni attendibili circa i livelli basali del rilascio di neurotrasmettitore. La maggior parte dei livelli basali è probabilmente il risultato di spillover trasmettitore da sinapsi9. Perché in molti casi il campionamento semplice del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico extra non è sufficiente a perseguire gli obiettivi di un'inchiesta, la tecnica della microdialisi può essere impiegata anche per stimolare i neuroni o di privarli di importanti ioni fisiologici come K+ o Ca2 +, al fine di evocare o impedire il rilascio del neurotrasmettitore.
Alta K+ stimolazione viene spesso utilizzata in neurobiologia per stimolare l'attività neuronale non solo negli animali svegli, ma anche nelle colture primarie e organotipiche. L'esposizione di un sano sistema nervoso centrale a soluzioni con alte concentrazioni di K+ (40-100 mM) evoca l'efflusso di neurotrasmettitori28. Questa capacità dei neuroni di fornire una versione aggiuntiva in risposta ad alta K+ può essere compromessa in animali epilettici1 e in altre malattie di neurodegenerative29,30. Allo stesso modo, il Ca2 + privazione (ottenuta irrorando soluzioni Ca2 + libera) viene utilizzata per stabilire calcio-dipendente rilascio di neurotrasmettitori più misurati dal microdialysis. Si ritiene generalmente che il Ca2 + dipendente rilascio è di origine neuronale, considerando che il rilascio di Ca2 + indipendente proviene da cellule gliali, ma molti studi sollevato polemiche sopra il significato di Ca2 +-misure sensibili di es. glutammato o GABA9: così, se possibile, si consiglia di sostenere gli studi di microdialisi con microsensor studi, come questi ultimi hanno una più alta risoluzione spaziale e gli elettrodi consente di avvicinarsi alla sinapsi31.
Per quanto riguarda gli studi di microdialisi in animali epilettici, è importante sottolineare che i dati ottenuti dalla maggior parte di essi si basano su video o video-EEG monitoraggio dei grippaggi, cioè, dell'occorrenza transitoria di segni e/o i sintomi dovuto anormale sincrone o eccessiva attività neuronale nel cervello32. Ci sono alcune specifiche dei grippaggi elettrografici negli animali trattato Pilocarpina che dovrebbero essere considerati quando si prepara l'esperimento. Crisi epilettiche spontanee sono seguiti da attività depressa con frequenti punti interictal di EEG3 e si verificano in cluster33,34. Sham azionati non-epilettici animali possono esibire grippaggio-come attività35 e pertanto i parametri per la valutazione di registrazioni EEG dovrebbero essere standardizzato36 e, se possibile, i tempi di microdialysis sessioni dovrebbero essere ben definito. Infine, ti raccomandiamo vivamente di seguire i principi e le norme metodologiche per controllo del video-EEG in roditori adulti controllo delineato dagli esperti della International League Against Epilepsy e società americana di epilessia nei loro rapporti molto recenti37 ,38.
Qui, descriviamo il microdialysis del glutammato e aspartato in parallelo con le registrazioni video-EEG a lungo termine negli animali epilettici e la loro analisi nel dializzato da HPLC. Ci metterà in risalto i passaggi critici del protocollo che uno dovrebbe prendersi cura di per il miglior risultato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Microdialisi sono una tecnica consolidata neuroscienze che correla le modifiche di neurologico attivi diffusione nello spazio interstiziale del cervello con il comportamento e/o con l'esito specifico di una patologia (ad es., crisi epilettiche per l'epilessia). Quando si studia l'epilessia, la tecnica della microdialisi è spesso combinata con a breve termine o addirittura a lungo termine dei video-elettroencefalografia (EEG) di monitoraggio per valutare la frequenza di grippaggio spontaneo, gravità, progressione e clustering. Il microdialysis-EEG combinato si basa sull'uso di diversi metodi e strumenti. Qui, abbiamo effettuato mediante microdialisi in vivo e continuo dei video-EEG registra a monitor di glutammato e aspartato di deflusso nel tempo, nelle diverse fasi della storia naturale dell'epilessia in un modello del ratto. Questo approccio combinato consente l'abbinamento delle modifiche nel rilascio del neurotrasmettitore con specifiche fasi della progressione e lo sviluppo della malattia. La concentrazione dell'amminoacido nel dializzato è stata determinata per cromatografia liquida. Qui, descriviamo il metodi e delineare le principali misure di precauzione uno dovrebbero prendere durante la microdialisi in vivo -EEG, con particolare attenzione alla chirurgia stereotassica, stimolazione basale e alto potassio durante microdialisi, profondità registrazione degli elettrodi EEG e analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni di aspartato e glutammato nel dializzato. Questo approccio può essere adattato per testare una varietà di droga o di malattia ha indotto cambiamenti delle concentrazioni fisiologiche di aspartato e glutammato nel cervello. A seconda della disponibilità di un appropriato test analitico, possono essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili quando si impiegano registrazione EEG allo stesso tempo.

Recupero della sonda
Il recupero medio (cioè, il contenuto medio dell'amminoacido nel perfusato come percentuale del contenuto in un volume uguale di soluzione flaconcino) era 15.49 ± 0,42% ad una portata di 2 μL/min e 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min per il glutammato e 14.89 ± 0,36% ad una portata di 2 ΜL/min e 10.13 ± 0.51 a 3 μL/min per aspartato quando si utilizza la sonda di membrana cuprophane. Se si utilizza la son...

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Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze come le alterazioni della neurochimica durante la storia naturale delle malattie neurologiche. Il principale vantaggio della tecnica EEG di microdialisi proposta è che tale approccio combinato consente l'accoppiamento dei cambiamenti nel rilascio del neurotrasmettitore all'interno di fasi specifiche dello sviluppo e della progressione della malattia. Inizia accendendo l'amplificatore posizionato al di fuori della gabbia di Faraday.Aprire il software EEG e avviare l'acquisizione EEG e osservare il segnale EEG prodotto da cavi non collegati. Successivamente, collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato tenendo la testa dell'animale tra due dita allungate di una mano e avvitando i connettori al piedistallo dell'elettrodo utilizzando l'altra mano libera. Impostare un fattore di amplificazione su ogni canale dell'amplificatore in base al segnale dell'elettrodo di un singolo animale in modo che il segnale EEG sia in scala.Quindi lascia che l'animale esplori la nuova gabbia per almeno un'ora sotto l'osservazione diretta del ricercatore. Regolare il cavo in base alla merce dell'animale e assicurarsi che i cavi non interferiscano con i movimenti dell'animale e la postura sdraiata. Infine, verificare la corretta inquadratura delle immagini sulle videocamere e quindi avviare la registrazione EEG video.Iniziare preparando le sonde di microdialisi per il primo utilizzo secondo la guida dell'utente del produttore e riempirle con la soluzione di Ringer. Quindi, tagliare pezzi di tubi FEP lunghi 10 centimetri e collegarli alle cannule di ingresso e uscita della sonda utilizzando gli adattatori di tubi di diversi colori. Assicurarsi che i tubi tocchino gli adattatori senza spazio morto in tutte le connessioni.Rimuovere la cannula fittizia dalla sua guida usando le pinzette tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda di microdialisi nella cannula guida e utilizzare l'argilla modellante per rassodare ulteriormente la cannula. Quindi, collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato.Quindi metti l'animale nel cilindro di plexiglass e lascialo esplorare il nuovo ambiente. Segui i movimenti dei topi svegli e che si muovono liberamente. Quindi, collegare l'ingresso della sonda alla siringa da 2,5 millilitri con un ago smussato calibro 22 contenente Ringer's Solution utilizzando gli adattatori per tubi.Spingere un millilitro della soluzione di Ringer nella sonda in 10 secondi spingendo continuamente il pistone della siringa da 2,5 millilitri. Verificare la caduta del liquido che appare sull'uscita per indicare quando la sonda è pronta per l'uso. Infine, riempire le siringhe da 2,5 millilitri collegate ai tubi FEP da adattatori tubolari con Ringer's Solution e montarle sulla pompa per infusione.Avviare la pompa a due microlitri al minuto e lasciarla funzionare durante la notte. Dopo aver verificato tramite video registrazioni EEG l'assenza di convulsioni nelle tre ore precedenti la raccolta del campione, arrestare la pompa che trasporta le siringhe cannulate del tubo FEP riempite con la soluzione di Ringer. Montare un altro set di siringhe da 2,5 millilitri collegate ai tubi FEP con adattatori per tubi riempiti con una soluzione ringer modificata contenente soluzione di potassio da 100 millimolare.Avviare la pompa a due microlitri al minuto e lasciarla funzionare. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema e assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazio morto in tutte le connessioni. Quindi, verificare la caduta del liquido che appare sulla presa per indicare quando la sonda è pronta per l'uso.Successivamente, collegare il tubo FEP delle siringhe riempito con la soluzione di Ringer alla cannula di ingresso della sonda in ogni animale e attendere la comparsa della goccia di liquido sulla punta dell'uscita. Collegare l'uscita della sonda al tubo FEP che porta alla raccolta nella provetta. Inserire il tubo FEP nella provetta chiusa da 0,2 millilitri con un tappo perforato e assicurarsi che il tubo rimanga in posizione fissarlo con un pezzo di argilla modellante.Dopo aver esistito la pompa a due microlitri al minuto per 60 minuti senza raccogliere campioni per equilibrare il sistema, raccogliere cinque campioni di dialisati consecutivi di 30 minuti in condizioni di base e conservare i campioni sul ghiaccio. Dopo 10 minuti, passare dalle siringhe contenenti 100 millimolare soluzione di ringer di potassio alla normale soluzione di suoneria e lasciare funzionare la pompa. Dopo la raccolta del quinto dialisato post-equilibrazione, raccogliere 20 frazioni di dialisato a microlitero ogni 10 minuti per un'ora.Quindi raccogliere altri tre campioni di dialisati di 30 minuti e arrestare la pompa. Infine, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius dopo l'esperimento fino all'analisi HPLC. Al termine dell'esperimento, sciacquare le sonde di microdialisi usate con acqua distillata e conservarle in una fiala piena di acqua distillata pulita fino al prossimo utilizzo.Infine, sciacquare l'intera configurazione della microdialisi con acqua distillata seguita dal 70% di etanolo. Sostituire l'etanolo con l'aria e conservare la configurazione in un ambiente sterile. Queste sono le tracce rappresentative dell'EEG registrate dall'ippocampo del controllo e dai ratti epilettici durante la fase cronica della malattia.Non è stata osservata alcuna alterazione EEG nei ratti di controllo, mentre un'attività epilettica parossismica sincronizzata è stata osservata circa 500 millisecondi prima e durante le convulsioni comportamentali nei ratti epilettici. La concentrazione di glutammato basale riscontrata nei ratti epilettici cronici era significativamente più alta che negli animali di controllo. L'alto potassio ha evocato un ulteriore rilascio di glutammato per circa 30 minuti nei ratti di controllo e per circa 60 minuti nei ratti epilettici cronici.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli animali impiantati con il dispositivo sono inclini a perderlo nel corso di un esperimento prolungato, quindi usa un set di testine leggere e cavi sufficientemente lunghi per evitare di interferire con la mobilità animale. A seconda della disponibilità di un saggio analitico appropriato, il metodo può essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili nel cervello quando si utilizza la registrazione EEG allo stesso tempo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo dell'epilessia di fornire una visione delle alterazioni della neurotrasmissione eccitatoria nel caso di un'epilessia del lobo temporale.Dopo aver visto questo video, confidiamo che avrai una migliore comprensione di come eseguire la microdialisi in vivo insieme alla registrazione EEG dell'elettrodo di profondità in un ratto epilettico liberamente in movimento.

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