Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Os autores desejam agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon e Eleonora Palma à sua contribuição para manuscritos publicados em precedência.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépti...

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente2). Re...

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA1 e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato2 por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, eletrofisiológicos e histopatológico3,4 e nós correlacionada à concentração do fluído de amino ácidos para suas diferentes fases: fase aguda após o insulto eletrofisiolÃ, a fase de latência, o tempo da primeira convulsão espontânea e a crônica phass5,6,7. Emoldurando as fases da doença foi habilitado pelo acompanhamento a longo prazo de vídeo-EEG e EEG preciso e caracterização clínica de convulsões espontâneas. Aplicação da técnica microdialysis associado com monitoramento de vídeo-EEG a longo prazo permitiu-na propor hipóteses mecanicistas para neuropatologia TLE. Em resumo, a técnica descrita neste manuscrito permite o emparelhamento de alterações neuroquímicas dentro de uma área do cérebro definidos com o desenvolvimento e progressão da epilepsia em um modelo animal.
Dispositivos emparelhados, compostos de um eletrodo de profundidade justaposto a uma microdialysis cânula, muitas vezes são empregados em estudos de investigação de epilepsia onde alterações em neurotransmissores, seus metabólitos ou substratos de energia devem ser correlacionadas com a atividade neuronal. Na maioria dos casos, é utilizado em livremente, comportando-se os animais, mas também pode ser conduzida de forma semelhante em seres humanos, por exemplo, na categoria fármaco-resistente pacientes epilépticos submetidos a investigação de eletrodo de profundidade antes da cirurgia8. Gravação de EEG e coleção do fluído podem ser realizada separadamente (por exemplo, implantar o eletrodo em um hemisfério e o microdialysis sonda em outro hemisfério, ou mesmo realizando o microdialysis em um grupo de animais durante a execução o único EEG em outro grupo de animais). No entanto, os eletrodos de acoplamento para sondas pode ter múltiplas vantagens: simplifica a cirurgia estereotáxica, limita o dano tecidual para apenas um hemisfério (enquanto o outro, deixando intacto, como um controle para estudos histológicos) e homogeneiza os resultados como estes são obtidos a partir da mesma região do cérebro e o mesmo animal.
Por outro lado, a preparação do dispositivo acoplado microdialysis sonda-eletrodo requer habilidade e tempo se for feito em casa. Um podia passar quantidades relativamente elevadas de dinheiro se tiver comprado no mercado. Além disso, quando microdialysis sondas (sonda dicas são tipicamente 200-400 µm de diâmetro e 7 a 12 mm de comprimento)9e eletrodos de EEG (pontas de eletrodo são geralmente de 300 a 500 µm de diâmetro e o tempo suficiente para alcançar a estrutura cerebral de juros10) são acoplado, o dispositivo montado representa um objeto relativamente pesado e volumoso, de um lado da cabeça, que é problemático para animais e propenso a ser perdidos, especialmente quando está ligado a bomba de diálise e o sistema de gravação de EEG de arame duro. Este aspecto é mais relevante em animais epilépticos que são difíceis de lidar e menos adaptável para as sessões do microdialysis. Técnicas cirúrgicas adequadas e cuidados pós-operatórios adequados podem resultar em implantes de longa duração que causam desconforto animal mínimo e devem ser perseguidos por combinatória microdialysis-EEG experimentos10,11, 12.
As vantagens e limitações da técnica microdialysis foram examinadas em pormenor pelos muitos neurocientistas. Sua principal vantagem sobre outras na vivo perfusão técnicas (por exemplo, fluxo rápido push-pull ou perfusão cortical Copa) é um pequeno diâmetro da sonda que cobre uma área relativamente precisa de interesse13,14, 15. Em segundo lugar, a membrana do microdialysis cria uma barreira física entre o tecido e o perfusato; Portanto, substâncias de alto peso molecular não cruzar e não interfiram com a análise de16,17. Além disso, o tecido é protegido contra o fluxo turbulento do perfusato18. Outra vantagem importante é a possibilidade de modificar o fluxo de perfusato para maximizar a concentração do analito no perfusato (ou seja, o processo de microdialysis pode ser bem definido matematicamente e podem ser modificado para produzir alto concentração do analito na amostra)19. Finalmente, a técnica pode ser usada para infundir a drogas ou substâncias farmacologicamente activas no tecido de interesse e para determinar o seu efeito no local da intervenção20. Por outro lado, o microdialysis tem um tempo de resolução limitada (normalmente mais de 1 min devido ao tempo necessário para a coleta de amostras) em comparação com sensores eletroquímicos ou biológicos; é uma técnica invasiva que provoca danos nos tecidos; compromete o equilíbrio neuroquímico no espaço ao redor da membrana devido ao gradiente de concentração contínua de todas as substâncias solúveis que entra o perfusato juntamente com o analito de interesse. Finalmente, a técnica do microdialysis é altamente influenciada pelos limites das técnicas analíticas utilizadas para a quantificação de substâncias no perfusato9,21,22,23 . A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), após derivatização com orthophthaldialdehyde para análise de glutamato e aspartato em amostras biológicas tem sido bem validado24,25,26 , 27 e sua extensa discussão está fora do escopo deste manuscrito, mas os dados produzidos por meio desse método serão descritos em detalhes.
Quando realizado corretamente e sem modificações da composição perfusato, microdialysis pode fornecer informações confiáveis sobre os níveis basais de liberação do neurotransmissor. A maior parte dos níveis basais é provavelmente o resultado das repercussões de transmissor de sinapses9. Porque em muitos casos a simples amostragem do neurotransmissor no espaço extra sináptico não é suficiente para prosseguir os objectivos de uma investigação, a técnica do microdialysis pode ser empregada também para estimular os neurônios ou privá-los de importante íons fisiológicos como K+ ou Ca2 +, de evocar ou evitar a liberação do neurotransmissor.
Alta estimulação K+ é usada frequentemente em neurobiologia para estimular a atividade neuronal, não só em animais acordados, mas também em culturas primárias e organotypic. A exposição de um sistema nervoso saudável para soluções com concentrações elevadas de K+ (40-100 mM) evoca o efluxo de neurotransmissores28. Essa capacidade dos neurônios para fornecer uma liberação adicional em resposta à alta K+ pode ser comprometida em animais epilépticos1 e em outras de29,de doenças neurodegenerativas30. Da mesma forma, o Ca2 + privação (obtida por perfusing soluções livres Ca2 + ) é usada para estabelecer o cálcio-dependente liberação de neurotransmissores mais medidos pelo microdialysis. Geralmente acredita-se que a liberação de Ca2 + dependente é de origem neuronal, Considerando que a liberação de Ca2 + independente origina glia, mas muitos estudos levantarem controvérsia sobre o significado de Ca2 +-medições sensíveis de, por exemplo, glutamato ou GABA9: assim, se possível, é aconselhável apoiar estudos microdialysis com estudos de microsensor, como estes últimos têm maior resolução espacial e os eletrodos permite para se aproximar de sinapses31.
Sobre microdialysis estudos em animais epilépticos, é importante salientar que os dados obtidos da maioria deles dependem de vídeo ou vídeo-EEG, monitoramento de convulsões, ou seja, da ocorrência de sinais e/ou sintomas devido a anormal transitória síncrona ou excessiva atividade neuronal no cérebro32. Existem algumas especificidades de electrographic convulsões em animais de pilocarpina Tratado que devem ser considerados na preparação do experimento. Convulsões espontâneas são seguidas por atividade deprimida com frequentes EEG picos interictais3 e ocorrem em aglomerados33,34. Sham operados não-epiléptica animais podem apresentar convulsão, como atividade35 e, portanto os parâmetros para avaliação de gravações de EEG devem ser padronizada36 e, se possível, o calendário de sessões do microdialysis deve ser bem definido. Finalmente, é altamente recomendável seguir os princípios e normas metodológicas para monitoramento de vídeo-EEG em roedores adultos controle descrito por peritos da Liga Internacional contra epilepsia e sociedade americana de epilepsia em seus relatórios muito recentes37 ,38.
Aqui, descrevemos microdialysis de glutamato e aspartato em paralelo com as gravações de vídeo-EEG a longo prazo em animais epilépticos e sua análise no dialisato por HPLC. Nós enfatizará os passos críticos do protocolo que um deve cuidar para obter melhores resultados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Recuperação de sonda
A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de me...

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Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nas neurociências, como as alterações na neuroquímica durante a história natural de doenças neurológicas. A principal vantagem da técnica proposta de EEG de microdiálise é que tal abordagem combinada permite o emparelhamento de alterações na liberação do neurotransmissor dentro de estágios específicos do desenvolvimento e progressão da doença. Comece ligando o amplificador posicionado fora da Gaiola faraday.Abra o software EEG e inicie a aquisição do EEG e observe o sinal EEG produzido por cabos não ligados. Em seguida, conecte o animal ao sistema de gravação EEG amarrado segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Defina um fator de amplificação em cada canal do amplificador de acordo com o sinal de eletrodo de um único animal para que o sinal EEG esteja em escala.Em seguida, deixe o animal explorar a nova gaiola por pelo menos uma hora sob a observação direta do pesquisador. Ajuste o cabo de acordo com a mercadoria do animal, e certifique-se de que os cabos não interfiram com os movimentos do animal e a postura mentirosa. Finalmente, verifique o enquadramento correto da imagem nas câmeras de vídeo e, em seguida, inicie a gravação de EEG de vídeo.Comece preparando os testes de microdiálise para o primeiro uso de acordo com o guia do usuário do fabricante e preencha-os com a Solução ringer. Em seguida, corte pedaços de 10 centímetros de comprimento de tubulação FEP e conecte-os às cânulas de entrada e saída da sonda usando os adaptadores de tubulação de diferentes cores. Certifique-se de que o tubo toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.Remova a cânula falsa de seu guia usando a pinça segurando firmemente a cabeça do animal. Insira a sonda de microdiálise na cânula guia e use argila de modelagem para firmar ainda mais a cânula. Em seguida, conecte o animal ao sistema de gravação EEG amarrado.Em seguida, coloque o animal no cilindro de plexiglass e deixe-o explorar o novo ambiente. Siga os movimentos de ratos acordados e livremente em movimento. Em seguida, conecte a entrada da sonda à seringa de 2,5 mililitros com uma agulha de calibre 22 com uma agulha de calibre 22 com corte contendo a Solução de Ringer usando os adaptadores de tubulação.Empurre um mililitro da Solução ringer para a sonda em 10 segundos empurrando o pistão da seringa de 2,5 mililitros continuamente. Verifique se há uma gota do líquido que aparece na tomada para significar quando a sonda estiver pronta para uso. Por fim, encha as seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP por adaptadores de tubo com a Solução de Ringer e monte-as na bomba de infusão.Ligue a bomba em dois microliters por minuto e deixe-a funcionar durante a noite. Depois de verificar através de gravações de EEG de vídeo a ausência de convulsões nas três horas anteriores à coleta de amostras, pare a bomba carregando as seringas canuladas de tubo FEP preenchidas com a Solução de Ringer. Monte outro conjunto de seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP com adaptadores de tubulação preenchidos com uma solução de Ringer modificada contendo solução de potássio de 100 mililitros.Ligue a bomba em dois microliters por minuto e deixe-a funcionar. Verifique se há falta de bolhas de ar no sistema e certifique-se de que o tubo toque nos adaptadores sem espaço morto em todas as conexões. Em seguida, verifique se há a gota do líquido que aparece na tomada para significar quando a sonda estiver pronta para uso.Em seguida, conecte a tubulação FEP de seringas preenchidas com a Solução ringer à cânula de entrada da sonda em cada animal e aguarde o aparecimento da gota líquida na ponta da tomada. Conecte a saída da sonda à tubulação FEP que leva à coleta no tubo de ensaio. Insira a tubulação FEP no tubo de ensaio fechado de 0,2 mililitro com uma tampa perfurada e certifique-se de que o tubo permaneça no lugar, fixando-o com um pedaço de argila de modelagem.Depois de executar a bomba em dois microliters por minuto durante 60 minutos sem coletar amostras para equilibrar o sistema, colete cinco amostras consecutivas de dialise de 30 minutos sob condições básicas e armazene amostras no gelo. Após 10 minutos, troque a tubulação das seringas contendo a solução do ringer de potássio de 100 milialares para a solução normal do Ringer e deixe a bomba funcionar. Após a coleta do quinto dialiseto pós-equilíbrio, colete 20 frações de dialiseto microliter a cada 10 minutos durante uma hora.Em seguida, colete três amostras adicionais de dialise de 30 minutos e pare a bomba. Por fim, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius após o experimento até a análise do HPLC. Após a conclusão do experimento, enxágue as sondas de microdiálise usadas com água destilada e armazene-as em um frasco cheio de água destilada limpa até o próximo uso.Finalmente, enxágue toda a configuração de microdiálise com água destilada seguida de 70% de etanol. Substitua o etanol por ar e armazene a configuração em um ambiente estéril. Estes são os traços representativos de EEG registrados a partir do hipocampo de controle e ratos epilépticos durante a fase crônica da doença.Não foi observada alteração de EEG em ratos de controle, enquanto uma atividade epileptiforme paroxística sincronizada foi observada cerca de 500 milissegundos antes e durante as convulsões comportamentais em ratos epilépticos. A concentração de glutamato basal encontrada em ratos epilépticos crônicos foi significativamente maior do que em animais de controle. O potássio alto evocou uma liberação adicional de glutamato por cerca de 30 minutos em ratos de controle e por cerca de 60 minutos em ratos epilépticos crônicos.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os animais implantados com o dispositivo são propensos a perdê-lo ao longo de um curso de experimento prolongado, por isso use um conjunto de cabeça leve e cabos suficientemente longos para evitar interferir na mobilidade animal. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, o método pode ser usado para testar diferentes moléculas solúveis no cérebro ao empregar o registro de EEG ao mesmo tempo. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu aos pesquisadores do campo da epilépologia fornecer uma visão das alterações na neurotransmissão excitatória no caso de uma epilepsia do lobo temporal.Depois de assistir a este vídeo, confiamos que você terá uma melhor compreensão de como realizar microdiálise in vivo juntamente com gravação de Eletrodo de profundidade EEG em um rato epiléptico em movimento livre.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Gravações de alta densidade EEG dos Ratos movimentando-se livremente usando Polyimide baseado microeletrodos

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Neurociência

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Gravações de EEG não invasiva de leitões movimentando-se livremente

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

Entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

Extracellular Electrophysiological Recording in the Motor Cortex of Mice

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

Advancements in Multichannel Extracellular Recording for Studying Neuronal Activity in Freely Moving Mice (Video) | JoVE

Gravação Extracelular Multicanal em Ratos em Movimento Livre

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...

Cerebrospinal Fluid and Blood Withdrawal from Rats with Concurrent EEG Recording

Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings

Obtaining High-Quality CSF and Blood Samples for Epilepsy Biomarker Discovery (Video) | JoVE

Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG

Because the composition of body fluids reflects many physiological and pathological dynamics, biological liquid samples are commonly obtained in many ...

Multilayer Imaging with Microprism in Head-Fixed and Freely Moving Animals

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

Author Spotlight: Comparative Imaging of Neural Activity in Awake and Freely Moving States

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...