Name: microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon y Eleonora Palma por su contribución a manuscritos publicados en precedencia.

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por la Universidad de Ferrara institucional Animal Care y Comité de uso y por el Ministerio italiano de salud (autorización: D.M. 246/2012-B) según las directrices esbozadas en las comunidades europeas Directiva del Consejo de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo está ajustado específicamente para la determinación de glutamato y aspartato en cerebro de rata dialysates obtenido bajo control EEG de microdialysis sesiones en ratas epilépticas ...

En este trabajo mostramos cómo se puede realizar una grabación continua de vídeo-EEG juntada con microdiálisis en un modelo experimental de ELT. Técnicas de grabación de vídeo-EEG se utilizan para diagnosticar correctamente las distintas fases de la progresión de la enfermedad en los animales y la técnica de microdiálisis se utiliza para describir los cambios en la liberación de glutamato que ocurren en el tiempo (no hay cambios se han encontrado para aspartato en un estudio previamente publicado<sup class="xr...

Para proporcionar la penetración en la debilitación funcional de mediada por glutamato excitatoria y la neurotransmisión inhibitoria GABAérgica resultando en convulsiones espontáneas en epilepsia de lóbulo temporal (ELT), supervisamos sistemáticamente las concentraciones extracelulares de GABA1 y más adelante los niveles de glutamato y aspartato2 por microdiálisis en el hipocampo ventral de ratas en varios momentos de la enfermedad natural curso, es decir, durante el desarrollo y progresión de la epilepsia. Tomamos ventaja del TLE pilocarpina modelo en ratas, que imita la enfermedad con mucha precisión en términos de cambios conductuales, electrofisiológico e histopatológico3,4 y correlacionamos la concentración del dializado de amino ácidos a sus diferentes fases: la fase aguda tras el insulto epileptogénica, la fase de latencia, el tiempo de la primera convulsión espontánea y la crónica phass5,6,7. Enmarcando las fases de la enfermedad fue habilitado por la supervisión del vídeo-EEG a largo plazo y la precisa EEG y caracterización clínica de las convulsiones espontáneas. Aplicación de la técnica de microdiálisis asociada a monitoreo video-EEG a largo plazo nos permitió proponer hipótesis mecanicistas de neuropatología TLE. En Resumen, la técnica descrita en este manuscrito permite el apareamiento de alteraciones neuroquímicas dentro de un área definida del cerebro con el desarrollo y progresión de la epilepsia en un modelo animal.
Dispositivos emparejados, formados por un electrodo de profundidad yuxtapuesto con una cánula de microdiálisis, a menudo se emplean en estudios de investigación de epilepsia donde cambios en los neurotransmisores y sus metabolitos, sustratos de energía deben ser correlacionados con la actividad neuronal. En la mayoría de los casos, se utiliza en comportarse libremente los animales, pero puede realizarse también de forma similar en los seres humanos, por ejemplo, en pacientes epilépticos fármaco-resistentes sometidos a investigación de electrodos de profundidad antes de la cirugía8. Grabación de EEG y recogida del dializado pueden realizarse por separado (por ejemplo, implantar el electrodo en un hemisferio y la microdiálisis la sonda en el otro hemisferio o incluso realizar el microdialysis en un grupo de animales mientras se realiza el EEG único en otro grupo de animales). Sin embargo, los electrodos de acoplamiento a las sondas puede tener múltiples ventajas: simplifica la cirugía estereotáctica, limita el daño a los tejidos a un sólo hemisferio (dejando la otra intacta, como un control para los estudios histológicos) y homogeneiza los resultados como estos se obtienen de la misma región del cerebro y el mismo animal.
Por otro lado, la preparación del dispositivo juntado microdialysis sonda electrodo requiere habilidades y tiempo si es hecho en casa. Uno podría pasar relativamente altas cantidades de dinero si comprado en el mercado. Por otra parte, cuando sondas de microdiálisis (puntas de prueba son típicamente 200-400 μm de diámetro y 7-12 mm de largo)9y los electrodos de EEG (puntas de los electrodos suelen ser de 300-500 μm de diámetro y el tiempo suficiente para llegar a la estructura cerebral de interés10) son junto, el dispositivo montado representa un objeto relativamente pesado y voluminoso en un lado de la cabeza, que es molesto para los animales y propensa a perder sobre todo cuando está conectado a la bomba de diálisis y el sistema de grabación de EEG de alambre duro. Este aspecto es más relevante en animales epilépticos que son difíciles de manejar y menos adaptables a las sesiones de microdiálisis. Las técnicas quirúrgicas adecuadas y cuidados postoperatorios adecuados pueden resultar en implantes de larga duración que causan mínimas molestias animales y deben ser perseguidos para experimentos de microdiálisis combinatoria-EEG10,11, 12.
Las ventajas y limitaciones de la técnica de microdiálisis han sido revisados en detalle por muchos neurocientíficos. Su principal ventaja sobre otras en vivo perfusión técnicas (p. ej., flujo rápido de vaivén o perfusión cortical Copa) es un pequeño diámetro de la sonda que cubre un área relativamente preciso de interés13,14, 15. En segundo lugar, la membrana de microdiálisis crea una barrera física entre el tejido y la solución; por lo tanto, sustancias de molecularidad elevada del peso no se cruzan y no interfieren con el análisis de16,17. Por otra parte, el tejido está protegido por el flujo turbulento de la solución18. Otra ventaja importante es la posibilidad de modificar el flujo de la solución para maximizar la concentración de analito en la solución (es decir, el proceso de microdiálisis pueden ser definido matemáticamente y puede ser modificado para alto rendimiento concentraciones del analito en la muestra)19. Por último, la técnica puede usarse para infundir los fármacos o sustancias farmacológicamente activas en los tejidos de interés y determinar su efecto en el sitio de intervención20. Por otro lado, microdiálisis tiene un tiempo de resolución limitada (típicamente más de 1 minuto por el tiempo necesario para recoger muestras) en comparación con los sensores electroquímicos o biológicos; es una técnica invasiva que causa daño a los tejidos; compromete el equilibrio neuroquímico en el espacio alrededor de la membrana debido al gradiente de concentración continua de todas las sustancias solubles que entra en la solución con el analito de interés. Por último, la técnica de microdiálisis está altamente influenciada por los límites de las técnicas analíticas empleadas para la cuantificación de sustancias en la solución9,21,22,23 . La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) después de la derivatización con orthophthaldialdehyde para el análisis de glutamato y aspartato en muestras biológicas ha sido bien validado24,25,26 , 27 y su amplia discusión está fuera del alcance de este manuscrito, pero los datos producidos mediante este método se describirá en detalle.
Cuando se realiza correctamente y sin modificaciones de la composición de la solución, microdialysis puede proporcionar información confiable sobre los niveles basales de la liberación de neurotransmisor. La mayor parte de los niveles básicos es probablemente el resultado del derrame de transmisor de la sinapsis9. Porque en muchos casos el muestreo simple del neurotransmisor en el espacio sináptico extra no es suficiente para perseguir los objetivos de la investigación, la técnica de microdiálisis se puede emplear también para estimular las neuronas o a privarlos de importantes fisiológicos iones como K+ o Ca2 +, con el fin de evocar o evitar la liberación del neurotransmisor.
Alta estimulación de K+ se utiliza a menudo en Neurobiología para estimular la actividad neuronal en animales despiertos, pero también en culturas primarias y organotypic. La exposición de un saludable del sistema nervioso central a las soluciones con altas concentraciones de K+ (40-100 mM) evoca la emanación de neurotransmisores28. Esta capacidad de las neuronas para proporcionar una versión adicional en respuesta a la alta K+ puede verse comprometida en animales epilépticos1 y en otras neurodegenerativas enfermedades29,30. Asimismo, el Ca2 + privación (obtenida por perfundiendo soluciones libres de Ca2 + ) se utiliza para establecer dependiente de calcio liberación de más neurotransmisores medidos por microdiálisis. Generalmente se cree que el comunicado dependiente de Ca2 + es de origen neuronal, mientras que sala independiente de Ca2 + origina de glia, pero muchos estudios levantado controversia sobre el significado de Ca2 +-medidas sensibles de p. ej. glutamato o GABA9: así, si es posible, es recomendable para apoyar estudios de microdiálisis microsensor estudios, ya que estos últimos tienen mayor resolución espacial y los electrodos permite acercarse a las sinapsis31.
Con respecto a los estudios de microdiálisis en animales epilépticos, es importante destacar que los datos obtenidos de la mayoría de ellos dependen de video o video-EEG monitoreo de asimientos, es decir, de la ocurrencia transitoria de signos o síntomas debido a la anormal excesiva o sincrónica actividad neuronal en el cerebro de32. Hay algunos detalles de asimientos electrográficos en animales de pilocarpina tratado que deben considerarse al preparar el experimento. Convulsiones espontáneas son seguidas por la deprimida actividad con frecuentes puntos interictales de EEG3 y ocurren en racimos33,34. Sham operados no epilépticos animales pueden exhibir actividad de asimiento-como35 y por lo tanto los parámetros para la evaluación de las grabaciones de EEG deben ser estandarizado36 y, si es posible, debe ser bien definido el calendario de sesiones de microdiálisis. Por último, le recomendamos siguiendo los principios y normas metodológicas para la supervisión del vídeo-EEG en roedores adultos control descrito por los expertos de la Liga Internacional contra la epilepsia y sociedad americana de la epilepsia en sus recientes informes37 ,38.
Aquí, describimos la microdiálisis de glutamato y aspartato en paralelo con las grabaciones de vídeo-EEG a largo plazo en animales epilépticos y su análisis en el dializado por HPLC. Haremos hincapié en los pasos críticos del protocolo que se debe cuidar para mejor resultado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-channel two-twisted electrode</td>
			<td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td>
			<td>MS333/3-B/SPC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide cannula</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.IC</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin KK2 Plastik</td>
			<td>Elettra Sport, Lecco, Italy</td>
			<td>KK2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Attack gel Loctite</td>
			<td>Henkel Italia Srl, Milano, Italy</td>
			<td>2047420_71941</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene-Ketamine</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>221300288 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Vet</td>
			<td>Merial, Toulouse, France</td>
			<td>103120022 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Altadol 50 mg/ ml - tramadol</td>
			<td>Formevet, Milano, Italy</td>
			<td>103703017 (AIC)</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentalyn 0.1% crm - gentamycine</td>
			<td>MSD Italia, Roma, Italy</td>
			<td>20891077 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simplex rapid dental cement</td>
			<td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td>
			<td>ACR811</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td>
			<td>Shofu, Kyoto, Japan</td>
			<td>PN1167</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe clip holder</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246;, Sweden</td>
			<td>p/n 100 5001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl&#174; Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td>
			<td>Roche, Monza, Italy</td>
			<td>019995063 (AIC)</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with 25G needle</td>
			<td>Vetrotecnica, Padova, Italy</td>
			<td>11.3500.05</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat flexible feeding needle 17G</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>7206</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Technology apparatus</td>
			<td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td>
			<td>M665G08</td>
			<td>Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modular data acquisition and&#160;analysis system MP150</td>
			<td>Biopac, Goleta, California, USA</td>
			<td>MP150WSW</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital video surveillance system</td>
			<td>AverMedia Technologies, Fremont, California, USA</td>
			<td>V4.7.0041FD</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>MAB 4.15.1.Cu</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialysis probe</td>
			<td>Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA</td>
			<td>S-8010</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>block heater</td>
			<td>Grant Instruments, Cambridge, England</td>
			<td>QBD2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer</td>
			<td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy</td>
			<td>711</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>864</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td>
			<td>800/100/100/100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1002</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red tubing adapters</td>
			<td>Agn Tho&#39;s, Lindig&#246; Sweden</td>
			<td>1003</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe with 22G needle</td>
			<td>Chemil, Padova, Italy</td>
			<td>S02G22</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vial cap</td>
			<td>Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic</td>
			<td>VCA-1004TB-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>septum</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td>
			<td>National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass insert with bottom spring</td>
			<td>Supelco, Sigma, Milano, Italy</td>
			<td>27400-U</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autosampler vial</td>
			<td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy</td>
			<td>C4013-2</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline manager 5000 system controller and degasser unit</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7602</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartline 1000 quaternary gradient pump</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>V7603</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrofluorometric detector</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>RF-551</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>25EK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatogrphic pre-column</td>
			<td>Knauer, Berlin, Germany</td>
			<td>P5DK181EBJ</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution A</td>
			<td>0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mobile phase solution B</td>
			<td>40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Ringer solution</td>
			<td>composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose solution</td>
			<td>10% sucrose in distilled water</td>
			<td></td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdialysis of excitatory amino acids during eeg recordings in freely moving rats

Microdiálisis es una técnica bien establecida de la neurociencia que correlaciona los cambios de sustancias neurológicamente activas que difunde en el espacio intersticial del cerebro con el comportamiento o con el resultado específico de una patología (por ejemplo, convulsiones para la epilepsia). Al estudiar la epilepsia, la técnica de microdiálisis se suele combinar con a corto plazo o a largo plazo incluso video-electroencefalografía (EEG de monitoreo para evaluar la frecuencia de las crisis espontáneas, severidad, progresión y agrupamiento). El EEG de microdialysis combinado se basa en el uso de varios métodos e instrumentos. Aquí realizamos la microdiálisis en vivo y vídeo-EEG continuo grabando para monitor salida de glutamato y aspartato en el tiempo, en diferentes fases de la historia natural de la epilepsia en un modelo de rata. Este enfoque combinado permite el emparejamiento de los cambios en la liberación de neurotransmisor con etapas específicas del desarrollo de la enfermedad y progresión. La concentración del aminoácido en el dializado se determinó por cromatografía líquida. Aquí, describimos los métodos y el contorno de las principales medidas cautelares se deben tomar durante la microdiálisis en vivo -EEG, con especial atención a la cirugía estereotáctica, potasio basal y alta estimulación durante microdialysis, profundidad grabación de electrodo EEG y análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de aspartato y glutamato en el dializado. Este enfoque puede ser adaptado probar una variedad de drogas o enfermedad inducida por cambios de las concentraciones fisiológicas de aspartato y glutamato en el cerebro. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico apropiado, puede utilizarse además para poner a prueba diferentes moléculas solubles al utilizar grabación de EEG al mismo tiempo.

Recuperación de la sonda
La recuperación media (es decir, el contenido medio del aminoácido en la solución como un porcentaje del contenido en un volumen igual de la solución vial) era 15.49 ± 0,42% a un caudal de 2 μL/min y 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min para glutamato y 14.89 ± 0,36% a un caudal de 2 ΜL/min y 10.13 ± 0,51 a 3 μL/min para aspartato cuando se usa la sonda de membrana cuprophane. Si se utiliza la sond...

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Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las neurociencias como las alteraciones en la neuroquímica durante la historia natural de las enfermedades neurológicas. La principal ventaja de la técnica de EEG de microdiálisis propuesta es que este enfoque combinado permite el emparejamiento de cambios en la liberación de neurotransmisores dentro de etapas específicas del desarrollo y progresión de la enfermedad. Comience encendiendo el amplificador situado fuera de la jaula Faraday.Abra el software EEG e inicie la adquisición de EEG y observe la señal EEG producida por cables no conectados. A continuación, conecte el animal al sistema de grabación EEG atado sosteniendo la cabeza del animal entre dos dedos estirados de una mano y atornillando los conectores al pedestal del electrodo usando la otra mano libre. Establezca un factor de amplificación en cada canal del amplificador de acuerdo con la señal de electrodo de un solo animal para que la señal EEG esté en escala.A continuación, deje que el animal explore la nueva jaula durante al menos una hora bajo la observación directa del investigador. Ajuste el cable de acuerdo con la mercancía del animal y asegúrese de que los cables no interfieran con los movimientos y la postura de acostarse del animal. Por último, compruebe si hay el encuadre de imagen correcto en las cámaras de vídeo y, a continuación, inicie la grabación de EEG de vídeo.Comience preparando las sondas de microdiálisis para el primer uso de acuerdo con la guía del usuario del fabricante y llénelos con la solución de Ringer. A continuación, corte trozos de 10 centímetros de largo de tubos FEP y conéctelos a las cánulas de entrada y salida de la sonda utilizando los adaptadores de tubería de diferentes colores. Asegúrese de que el tubo toca los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.Retire la cánula ficticia de su guía usando las pinzas sosteniendo la cabeza del animal firmemente. Inserte la sonda de microdiálisis en la cánula guía y utilice arcilla de modelado para reafirmar aún más la cánula. A continuación, conecte el animal al sistema de grabación EEG atado.A continuación, poner el animal en el cilindro de plexiglás y dejar que explore el nuevo entorno. Siga los movimientos despiertos y libremente en movimiento de las ratas. A continuación, conecte la entrada de la sonda a la jeringa de 2,5 mililitros con una aguja de calibre 22 contundente que contenga la solución de Ringer utilizando los adaptadores de tubería.Empuje un mililitro de la solución de Ringer en la sonda en 10 segundos empujando el pistón de la jeringa de 2,5 mililitros continuamente. Compruebe la caída del líquido que aparece en la toma de corriente para indicar cuándo la sonda está lista para su uso. Por último, llene las jeringas de 2,5 mililitros conectadas a los adaptadores de tubo FEP mediante adaptadores de tubo con la solución de Ringer y colóquelas en la bomba de perfusión.Encienda la bomba a dos microlitros por minuto y déjela funcionar durante la noche. Después de verificar a través de video EEG graba la ausencia de convulsiones en las tres horas anteriores a la recolección de muestras, detenga la bomba que lleva las jeringas canuladas FEP llenas con la solución de Ringer. Monte otro conjunto de jeringas de 2,5 mililitros conectadas a tubos FEP con adaptadores de tubo llenos de una solución de Ringer modificada que contenga 100 solución de potasio milimiolar.Encienda la bomba a dos microlitros por minuto y déjela funcionar. Compruebe la ausencia de burbujas de aire en el sistema y asegúrese de que el tubo toca los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones. A continuación, compruebe si la gota del líquido que aparece en la toma de corriente significa cuando la sonda está lista para su uso.A continuación, conecte el tubo FEP de las jeringas llenas con la solución de Ringer a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y espere a que la aparición del líquido caiga en la punta de la salida. Conecte la salida de la sonda al tubo FEP, lo que conduce a la recogida en el tubo de ensayo. Inserte el tubo FEP en el tubo de ensayo cerrado de 0,2 mililitros con una tapa perforada y asegúrese de que el tubo permanezca en su lugar fijándolo con un trozo de arcilla de modelado.Después de ejecutar la bomba a dos microlitros por minuto durante 60 minutos sin recoger muestras para equilibrar el sistema, recoja cinco muestras consecutivas de dialesato de 30 minutos en condiciones de referencia y almacene muestras en hielo. Después de 10 minutos, cambie el tubo de las jeringas que contienen 100 soluciones de Ringer de potasio milimétrica a la solución normal de Ringer y deje que la bomba funcione. Después de la recolección del quinto dialato post-equilibrio, recoja 20 fracciones de dialato de microlitros cada 10 minutos durante una hora.A continuación, recoja tres muestras de dialato de 30 minutos adicionales y detenga la bomba. Por último, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados después del experimento hasta el análisis de HPLC. Una vez completado el experimento, enjuague las sondas de microdiálisis usadas con agua destilada y guárdelas en un vial lleno de agua destilada limpia hasta su próximo uso.Por último, enjuague toda la configuración de microdiálisis con agua destilada seguida de un 70 por ciento de etanol. Reemplace el etanol por aire y almacene la configuración en un entorno estéril. Estos son los rastros representativos del EEG registrados desde el hipocampo de las ratas de control y epilépticos durante la fase crónica de la enfermedad.No se observó alteración del EEG en ratas de control, mientras que se observó una actividad epileptiforma paroxística sincronizada unos 500 milisegundos antes y durante las convulsiones conductuales en ratas epilépticas. La concentración basal de glutamato encontrada en ratas epilépticas crónicas fue significativamente mayor que en animales de control. El alto nivel de potasio evocó una liberación adicional de glutamato durante unos 30 minutos en ratas de control y durante unos 60 minutos en ratas epilépticas crónicas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los animales implantados con el dispositivo son propensos a perderlo durante un experimento prolongado, por lo que utilizar un conjunto de cabeza ligera y cables lo suficientemente largos para evitar interferir con la movilidad animal. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, el método se puede utilizar más para probar diferentes moléculas solubles en el cerebro cuando se emplea la grabación de EEG al mismo tiempo. Después de su desarrollo, esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la epileptología proporcionar una visión de las alteraciones en la neurotransmisión excitatoria en el caso de una epilepsia del lóbulo temporal.Después de ver este video, confiamos en que usted tendrá una mejor comprensión de cómo realizar la microdiálisis in vivo junto con la grabación de electrodo de profundidad EEG en una rata epiléptica que se mueve libremente.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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