Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

الكتاب يود أن ينوه الدكتور واد سيجوردسون لتقديم مساهمة قيمة في تصميم جهاز التدفق.

1-تجميع جهاز تدفق
<ol><li>تكوين أجزاء مدرجة في الجدول للمواد حسب التخطيطي في الشكل 1 مع الاعتبارات التي نوقشت أدناه. ملاحظة: لمزيد من الراحة، الجانب تدفق الأجهزة ينقسم إلى الجانبين، الجانب الأخضر (كل شيء المنبع الشريحة إلى قوارير وسائل الإعلام)، والبرتقال (كل شيء ال...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

باستخدام نظام تدفق كما هو مبين أعلاه يسمح لتوليد كمية من أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين بيوفيلم الفطرية في النمو والتنمية. للسماح بإجراء مقارنات بين التجارب أنها ذات أهمية حاسمة لضمان بقاء المعلمات التصوير نفسه. وهذا يشمل ضمان أن يتم إعداد المجهر لإنارة كوهلر لكل تجربة (أدلة كثيرة على شبك...

المبيضات البيض (المبيضة) هو الممرضات فطرية انتهازية من البشر التي يمكن أن تصيب العديد من أنواع الأنسجة، بما في ذلك الأسطح المخاطية الفموية وتسبب داء المبيضات المكنسية ونتج عنه انخفاض نوعية حياة للأفراد المتضررين1. تشكيل بيوفيلم سمة هامة للآلية المرضية المبيضة، وقد أجريت دراسات عديدة على تكوين ووظيفة المبيضة الأغشية الحيوية2،،من34، 5، أجريت الكثير منها ثابت (لا التدفق) في المختبر باستخدام النماذج. ومع ذلك، المبيضة يجب التقيد وتنمو حضور تدفق اللعاب في تجويف الفم. وقد وضعت العديد من نظم تدفق للسماح لخلية يعيش التصوير6،،من78،9،10. وقد صممت هذه الأنظمة تدفق مختلفة لأغراض مختلفة، وذلك كل نظام مختلف نقاط القوة والضعف. وجدنا أن العديد من تدفق النظم الملائمة المبيضة كانت مكلفة، المعقدة المطلوبة ملفقة أجزاء، أو يمكن عدم تصويرها أثناء تدفق وكان أن توقفت قبل التصوير. ولذلك، قمنا بتطوير جهاز تدفق رواية لدراسة المبيضة بيوفيلم تشكيل إطار تدفق11. أثناء تصميم جهازنا التدفق، تابعنا هذه الاعتبارات الرئيسية. أولاً، أننا نريد أن تكون قادرة على قياس جوانب متعددة من بيوفيلم النمو والتنمية في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى استخدام خلايا الفلورسنت (مما يسمح لنا لدراسة سلالات متحولة ويعزل السريرية غير معدلة بسهولة). ثانيا، كنا نريد جميع أجزاء لتكون متاحة تجارياً مع قليل من لا تعديلات (أي.، لا تلفيق مخصصة)، والسماح للآخرين بأكثر بسهولة إعادة إنشاء نظامنا، والسماح للتصليح سهلة. ثالثا، أردنا أيضا للسماح بتمديد التصوير مرات في معدلات التدفق مرتفعة بشكل معقول. وأخيراً، أردنا، بعد فترة من الخلايا إرفاق الركيزة تحت التدفق، لتكون قادرة على رصد النمو بيوفيلم على مدى فترة طويلة دون إدخال خلايا جديدة.
هذه الاعتبارات أدت بنا إلى تطوير نظام تدفق تدوير قارورة اثنين هو موضح في الشكل 1. قوارير اثنين تسمح لنا بتقسيم هذه التجربة إلى مرحلتين، مرحلة مرفق يستمد من قارورة مرفق المصنف الخلية، ومرحلة نمو التي تستخدم وسائل الإعلام الحرة خلية على مواصلة نمو بيوفيلم دون إضافة خلايا جديدة. صمم هذا النظام للعمل مع غرفة حضانة للمجهر، مع الشريحة والأنابيب السابقة لها (2 إلى 5، الشكل 1) يتم وضعها داخل الحاضنة، وتوضع جميع المكونات الأخرى في حاوية كبيرة ثانوي خارج المجهر. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام محرض هوتبلت مع مسبار درجة حرارة مرفقة الحفاظ على الخلايا الفطرية في قارورة المرفقات عند 37 درجة مئوية. كما أنه يتم تعميم، هذا النظام قادر على تصوير مستمر أثناء تدفق (يمكن أن يكون أكثر من 36 ح تبعاً للظروف)، ويمكن استخدامها على المجاهر الأكثر القياسية، بما في ذلك مجاهر benchtop رأسي أو مقلوب. هنا، نحن مناقشة الجمعية العامة، عملية، وتنظيف جهاز تدفق، كذلك كما تقدم بعض الخوارزميات ImageJ الكمية الأساسية لتحليل أشرطة الفيديو بعد تجربة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

في داء المبيضات المكنسية، يجب التقيد بأعضاء جنس المبيضات وتنمو على سطح الغشاء المخاطي الشفوي في حين ظل آثار تدفق اللعاب. بينما تم تطوير نماذج للنمو في ظل تدفق، العديد من هذه النظم غالية الثمن، أو عدم السماح بالتصوير في حين الخلايا قيد التدفق. قمنا بتطوير جهاز رواية التي تسمح لنا بصورة نمو وتطور الخلايا المبيضات البيض في ظل تدفق وفي الوقت الحقيقي. هنا، نحن تفاصيل البروتوكول للجمعية واستخدام هذا الجهاز التدفق، فضلا عن التحديد الكمي للبيانات التي يتم إنشاؤها. نحن قادرون على تحديد المعدلات التي نعلق على الخلايا، وفصل من الشريحة، فضلا عن تحديد مقياس للكتلة الأحيائية على الشريحة مع مرور الوقت. هذا النظام اقتصادا وتنوعاً، وتعمل مع العديد من أنواع المجاهر الخفيفة، بما فيها مجاهر benchtop غير مكلفة، على حد سواء، وقادر على تمديد التصوير مرات مقارنة بغيرها من نظم تدفق. عموما، هذا هو نظام منخفضة الإنتاجية التي يمكن أن توفر معلومات مفصلة للغاية في الوقت الحقيقي على نمو بيوفيلم الأنواع الفطرية تحت التدفق.

الممثل صور عادية بين عشية وضحاها الوقت الفاصل بين تجربة استخدام البرية من نوع المبيضة يمكن رؤية الخلايا عند 37 درجة مئوية في الشكل 2ألف و التكميلي فيديو 1. وقد الصور التباين المحسن لتحسين الرؤية. تم إجراء القياس الكمي للبيانات الأصلي...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

يصف لنا الجمعية العامة، عملية، وتنظيف جهاز تدفق تهدف إلى تكوين بيوفيلم الفطرية الصور في الوقت الحقيقي في حين ظل تدفق. ونحن أيضا تقديم ومناقشة خوارزميات الكمية المراد استخدامه على الصور المكتسبة.

التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة، مثل كيفية تغيير تدفق السوائل نمو وتطور الأغشية الحيوية الفطرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتقييم كمي لآثار التدفق على نمو وتطور الأفلام الحيوية في الوقت الحقيقي. تبدأ هذه التجربة مع تجميع جهاز تدفق، كما هو موضح في بروتوكول النص.في يوم التجربة، قم بإرفاق فخ الفقاعة، ومسبار درجة الحرارة، وجميع مكونات الاستخدام الفردية. لتجميع المرشح، قم بإزالة المكبس من حقنة ذات ملليلتر واحدة لجعله محولًا. فرض الأنابيب من زجاجة تصفية في هذه الغاية واربط مرشح 2 ميكرون إلى الأنابيب المؤدية إلى قارورة النمو.تطبيق الشحوم فراغ سيليكون حول بارب من محول الشريحة قبل توصيله، وهذا يساعد على منع تسرب الهواء في النظام. ملء قارورة المرفق مع 100 ملليلتر من YPD، وملء قارورة النمو مع 200 ملليلتر من YPD. تأكد من أن أنابيب الجانب الأخضر تصل إلى وسائل الإعلام في كل قارورة.تأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة. إرفاق فخ فقاعة إلى فراغ، وربط المضخة إلى الجانب الأخضر أنابيب المصب من فخ فقاعة. ضخ السائل بمعدل تدفق 3.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لملء تماما الجانب الأخضر.ثم dispense والتخلص من ما يقرب من 1-2 ملليلتر من وسائل الإعلام، لأن أول زوجين من milliliters غالبا ما تحتوي على خلايا ميتة أو الحطام العشوائي. تأكد من أن الجانب الأخضر من الأنابيب مليء وسائل الإعلام وليس لديه فقاعات المصب من فخ فقاعة قبل المضي قدما. ملء شريحة القناة والخزان مع YPD، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.قم بتوصيل الشريحة بجهاز التدفق. ثم ضخ المزيد من السوائل لإنشاء عازلة من حوالي 5 أمتار على الجانب البرتقالي. هذا هو لمنع بطريق الخطأ محاصرة الهواء في الشريحة في حالة تدفق الظهر.الآن، وإعداد جهاز تدفق للنقل إلى المجهر عن طريق أول زرع مدخل ومنفذ من فخ فقاعة مغلقة. ثم المشبك الأخضر والبرتقالي جانب مرفق صمامات مغلقة. تأكد من أن قبعات المسمار لإخماد النبض وزجاجة مرشح ضيقة، لأنها يمكن أن تخفف أثناء الطلاء التلقائي.افصل المضخة من الأنابيب لتسهيل النقل. ثم نقل جميع المكونات، بما في ذلك لوحة الساخنة، في حاوية ثانوية بالقرب من المجهر. إرفاق مسبار درجة الحرارة إلى مُحرّك الصفيحة الساخنة، والبدء في تسخين قارورة المرفق إلى 37 درجة مئوية.حرك وسائل الإعلام في 300 دورة في الدقيقة، والحفاظ على هذا لكامل التجربة. قم بتركيب الشريحة على المجهر، واستخدم الشريط إذا لزم الأمر لتأمينه بإحكام. ثم نعلق فخ فقاعة إلى فراغ.الآن، قم بتوصيل المضخة بجهاز التدفق. بدء المضخة بمعدل تدفق 3.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، والسماح لها لتشغيل لمدة خمس إلى 10 ثوان تقريبا. ثم، إزالة فخ فقاعة في السماح التدريجي عشيرة غطاء.السماح للمضخة لمواصلة تشغيل بينما قارورة المرفقات يسخن. مرة واحدة في قارورة المرفق وغرفة الحضانة على حد سواء في 37 درجة مئوية، إضافة ما يكفي من ثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا الفطرية إلى قارورة المرفق للوصول إلى مليون خلية لكل ملليلتر. انتظر 15 دقيقة للسماح للخلايا بالتأقلم.فتح كل من صمامات قارورة جانبية خضراء وبرتقالية مع إغلاق كل من صمامات قارورة النمو لبدء تدفق الخلايا. انتظر لمدة خمس دقائق تقريباً للسماح للخلايا بالوصول إلى الشريحة. خلال هذا الوقت، ركز المجهر وضبطه مع نفس معلمات التصوير المستخدمة في التجارب السابقة.ابدأ الحصول على الصورة لمرحلة المرفق. تحقق مرة أخرى بعد حوالي خمس دقائق و 10 لضمان الحفاظ على التركيز. إذا لم يكن كذلك، حاول ضبط التركيز مباشرة بعد الحصول على الصورة التالية.بعد الانتهاء من مرحلة المرفق مباشرة، قم بحفظ الملف. ثم فتح كل من صمامات قارورة الجانب الأخضر والبرتقالي مع إغلاق كل من صمامات قارورة المرفق. الحرص على عدم عثرة المرحلة إذا كانت هناك أي صمامات داخل غرفة الحضانة.افصل مسبار ميزان الحرارة، واستبدل قارورة المرفق بقارورة النمو. الآن ، تكوين البرنامج للحصول على صورة كل 15 دقيقة على مدى 22 ساعة ، والبدء في الحصول على صورة لمرحلة النمو. بمجرد الانتهاء من عملية الاستحواذ على مرحلة النمو وحفظ الملف ، افتح صمامات قارورة المرفقات الجانبية الخضراء والبرتقالية ، والتي قد تجعل من الضوضاء إطلاقات الضغط على الجانب البرتقالي.سحب ما يصل على أنابيب الجانب الأخضر القادمة من كل من قارورة وسائل الإعلام، حتى أنها على الأقل عدة سنتيمترات فوق وسائل الإعلام. ثم، تشغيل المضخة بسرعة عالية لإزالة جميع وسائل الإعلام من الأنابيب، مما يجعل التنظيف أسهل بكثير. وأخيراً، كمي مقاطع الفيديو كما هو موضح في بروتوكول النص.هذا الوقت الفاصل الظلام حقل المجهر الفيديو يظهر تعلق من نوع البرية المبيضات الخلايا ألبيكية إلى الركيزة تحت التدفق خلال مرحلة المرفق، تليها النمو والتطور اللاحقة خلال مرحلة النمو مما يؤدي إلى تشكيل بيو فيلم. يمكن تحليل البيانات من هذه الفيديوهات عن معدلات مرفق الخلايا وفرزها والكتلة الحيوية مع مرور الوقت، وتظهر هنا الكتلة الحيوية الإجمالية داخل منطقة التصوير كما يحددها تحليل قياس الكثافة. كما يتم عرض المعدل التراكمي لمرفق الخلية وفرز الكتلة الحيوية في المائة مع مرور الوقت.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام نفس ظروف التصوير في جميع التجارب، لأن هذا يسمح بإجراء مقارنات كمية بينهما.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية عن طريق اختبارات بيولوجية على النواة

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...