Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Wade Sigurdson bestätigen für die Bereitstellung von wertvollen Beitrag bei der Gestaltung des Apparates fließen.

1. Montieren Sie den Flow-Apparat
<ol><li>Konfigurieren Sie die Teile mit den unten beschriebenen Überlegungen in die Tabelle der Materialien gemäß dem Schaltplan in Abbildung 1 aufgeführt. Hinweis: der Einfachheit halber der Fluss Apparat gliedert sich in zwei Seiten, die grüne Seite (alles oberhalb der Folie in die Medien-Fläschchen) und die Orange Seite (alles unterhalb der Folie in die Medien-Fläschchen).<ol>
<li>Sicherstellen Sie, dass alle Fluss-Apparat ist...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Mit Hilfe der Flow-System ermöglicht wie oben beschrieben für die Generation der quantitativen Zeitraffer-Videos von Pilz Biofilm Wachstum und Entwicklung. Um Vergleiche zwischen Experimente zu ermöglichen ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die bildgebenden Parameter gleich gehalten werden. Dazu gehört, dass das Mikroskop für Köhler Beleuchtung für jedes Experiment eingerichtet ist, (viele Guides sind online verfügbar für diesen Prozess). Abgesehen von imaging-Parameter, gibt es einige...

Candida albicans (C. Albicans) ist eine opportunistische pilzliche Erreger von Menschen, die viele Gewebetypen, einschließlich mündliche Schleimhaut-Oberflächen, wodurch oropharyngealen Candidose und daraus resultierende in eine geringere Lebensqualität für die betroffenen Personen1infizieren können. Biofilmbildung ist ein wichtiges Merkmal für die Pathogenese von C. Albicans, und zahlreiche Studien haben auf die Bildung und Funktion von C. Albicans Biofilme2,3,4getan wurde, 5, viele davon wurden durchgeführt mit statisch (keine Strömung) in-vitro- Modelle. Allerdings müssen C. Albicans halten und wachsen in Gegenwart von Speichel fließen in die Mundhöhle. Zahlreiche Flow-Systeme wurden entwickelt, um für live Cell imaging6,7,8,9,10ermöglichen. Diese verschiedenen Flow-Anlagen sind für verschiedene Zwecke konzipiert und daher jedes System hat unterschiedliche Stärken und Schwächen. Wir fanden, dass viele der Strömung, die Systeme für C. Albicans angemessen waren kostspielig, erforderliche Anlage fabriziert Teile, oder könnte nicht abgebildet im Fluss und vor Bildgebung gestoppt werden musste. Daher entwickelten wir eine neuartige Strömung Apparat um C. Albicans Biofilmbildung unter Fluss11zu studieren. Bei der Konzeption unserer Flow-Apparate folgten wir dieser wichtigen Überlegungen. Erstens wollten wir mehrere Aspekte der Biofilm Wachstum und Entwicklung in quantifizieren zu können ohne die Verwendung von fluoreszierenden Zellen (so dass uns Studie mutierte Stämme und unveränderten klinischen Isolaten leicht) in Echtzeit. Zweitens wollten wir alle Teile mit wenig bis keine Änderungen im Handel erhältlich sein (zB., keine eigene Fertigung), andere mehr einfach unser System neu und für einfache Reparaturen. Drittens: Wir wollten auch ermöglichen längere Zeiten bei relativ hohen Flussraten imaging. Schließlich wollten wir, nach einer Phase der Zellen, die Befestigung auf dem Untergrund durch fließen, der Biofilm-Wachstum über einen längeren Zeitraum ohne Einführung neue Zellen überwachen zu können.
Diese Überlegungen führten uns zu zwei Kolben rezirkulierenden Flow-System in Abbildung 1dargestellt. Die zwei Kolben ermöglichen es uns, das Experiment in zwei Phasen, eine Anlage-Phase, die aus der Zelle ausgesät Anlage Flasche zieht und eine Wachstumsphase, die zellfreien Medien nutzt, um den Biofilm wachsen ohne den Zusatz von neuen Zellen aufgeteilt. Dieses System dient zur Arbeit mit einer Inkubation Kammer für das Mikroskop mit der Folie und der Schlauch davor (2 bis 5, Abbildung 1) in die brutmaschine gelegt und alle anderen Komponenten in einem großen sekundären Behälter außerhalb der Mikroskop. Darüber hinaus eine Herdplatte Rührer mit einem angeschlossenen Temperaturfühler verwendet wird, um Pilzzellen in der Anlage Kolben bei 37 ° c zu halten Wie es Rezirkulation ist, dieses System ist in der Lage, kontinuierliche Bildgebung während Flow (kann über 36 h je nach Bedingungen), und auf die gängigen Mikroskope, einschließlich aufrecht oder invertierte Benchtop Mikroskopen verwendet werden kann. Hier diskutieren wir die Montage, Betrieb, und Reinigung des Apparates fließen, sowie als bieten einige grundlegende ImageJ quantitativen Algorithmen, die Videos nach einem Experiment zu analysieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

Im oropharyngealen Candidose müssen Mitglieder der Gattung Candida halten und wachsen auf der mündlichen Schleimhautoberfläche während unter dem Einfluss von Speichel fließen. Während Modelle für das Wachstum unter Strömung entwickelt wurden, viele dieser Systeme sind teuer oder nicht zulassen, imaging, während die Zellen unter Strom stehen. Wir haben ein neuartiges Gerät entwickelt, das uns erlaubt, das Wachstum und die Entwicklung von Candida Albicans Zellen durch fließen und in Echtzeit-Bild. Hier zeigen wir das Protokoll für die Montage und Nutzung von dieser Strömung Apparat sowie die Quantifizierung der Daten, die generiert werden. Wir sind in der Lage, die Preise zu quantifizieren, die die Zellen zum Anfügen und trennen von Folie, sowie ein Maß für die Biomasse auf der Folie im Laufe der Zeit zu bestimmen. Dieses System ist wirtschaftlich und vielseitig, mit vielen Arten von Lichtmikroskopen, einschließlich preiswerte Benchtop Mikroskopen arbeiten und ist in der Lage, erweitert imaging Zeiten im Vergleich zu anderen wasserführenden Systemen. Insgesamt ist dies ein niedriger Durchsatz-System, die sehr detaillierte Echtzeit-Informationen auf das Wachstum von Biofilm Pilzarten unter Strom liefern kann.

Repräsentative Bilder eines normalen Übernachtung Zeitraffer Experiment mit Wildtyp C. Albicans Zellen bei 37 ° C in Abbildung 2A und ergänzenden Video 1gesehen werden. Die Bilder wurden Kontrast verbessert, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Quantifizierung der Originaldaten wurde durchgeführt und repräsentative Grafiken sehen in Abbildung 2B. Um diese Diagramme z...

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Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z. B. wie Der Flüssigkeitsfluss das Wachstum und die Entwicklung von Pilzbiofilmen verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Flusses auf das Wachstum und die Entwicklung von Biofilmen in Echtzeit quantitativ zu bewerten. Beginnen Sie dieses Experiment mit der Montage des Strömungsgeräts, wie im Textprotokoll beschrieben.Befestigen Sie am Tag des Experiments die Blasenfalle, die Temperatursonde und alle Einzelkomponenten. Um den Filter zu montieren, entfernen Sie den Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze, um ihn zu einem Adapter zu machen. Zwingen Sie die Schläuche aus der Filterflasche in dieses Ende und befestigen Sie einen 2 Mikron Filter an den Schläuchen, die zum Wachstumskolben führen.Tragen Sie Silikonvakuumfett um die Widerhaken des Schiebeadapters auf, bevor Sie ihn anschließen, da dies hilft, Luftlecks in das System zu verhindern. Füllen Sie den Befestigungskolben mit 100 Milliliter YPD und füllen Sie den Wachstumskolben mit 200 Milliliter yPD. Stellen Sie sicher, dass der grüne Seitenschlauch die Medien in jedem Kolben erreicht.Stellen Sie sicher, dass alle Ventile geöffnet sind. Befestigen Sie die Blasenfalle an einem Vakuum, und schließen Sie die Pumpe an den grünen Seitenschlauch nach der Blasenfalle an. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliter pro Minute, um die grüne Seite vollständig zu füllen.Dann geben und entsorgen Sie etwa ein bis zwei Milliliter der Medien, da die ersten Paar Milliliter oft abgestorbene Zellen oder zufällige Trümmer enthalten. Stellen Sie sicher, dass die grüne Seite des Schlauches mit Medien gefüllt ist und keine Blasen unterhalb der Blasenfalle hat, bevor Sie fortfahren. Füllen Sie den Kanalschlitten und das Reservoir mit YPD, wobei Darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen.Schließen Sie die Folie an das Durchflussgerät an. Dann pumpen Sie mehr Flüssigkeit, um einen Puffer von etwa 5 Metern auf der orangen Seite zu schaffen. Dadurch soll verhindert werden, dass bei Rückfluss versehentlich Luft in der Rutsche eingefangen wird.Bereiten Sie nun das Strömungsgerät für den Transport zum Mikroskop vor, indem Sie zuerst den Ein- und Auslass der Blasenfalle geschlossen pflanzen. Dann klemmen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungsventile geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Schraubverschlüsse für den Pulsationsdämpfer und die Filterflasche dicht sind, da sie sich während der Autoplatierung lösen können.Trennen Sie die Pumpe von den Schläuchen, um den Transport zu erleichtern. Dann verschieben Sie alle Komponenten, einschließlich des Heißplattenrührers, in einen sekundären Behälter in der Nähe des Mikroskops. Befestigen Sie den Temperaturfühler am Heißplattenrührer und beginnen Sie mit dem Erhitzen des Befestigungskolbens auf 37 Grad Celsius.Rühren Sie die Medien bei 300 RPM, und halten Sie dies für das gesamte Experiment aufrecht. Montieren Sie das Dia am Mikroskop, und verwenden Sie ggf. Klebeband, um es fest zu befestigen. Befestigen Sie dann die Blasenfalle an einem Vakuum.Schließen Sie nun die Pumpe an das Durchflussgerät an. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliterpro Minute, und lassen Sie sie etwa fünf bis zehn Sekunden laufen. Dann entfernen Sie die Blasenfalle im ausgelassenen Deckel-Clan.Lassen Sie die Pumpe weiterlaufen, während sich der Befestigungskolben erwärmt. Sobald der Befestigungskolben und die Inkubationskammer bei 37 Grad Celsius sind, fügen Sie genügend Nachtkultur der Pilzzellen zum Befestigungskolben hinzu, um eine Million Zellen pro Milliliter zu erreichen. Warten Sie 15 Minuten, damit sich die Zellen akklimatisieren.Öffnen Sie sowohl grüne als auch orange Seitenbefestigungsventile, während Sie beide Wachstumskolbenventile schließen, um den Zellfluss zu starten. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis Zellen die Folie erreichen können. Während dieser Zeit konzentrieren Sie das Mikroskop und passen Sie es an die gleichen bildgebenden Parameter an, die in früheren Experimenten verwendet wurden.Beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Anlagenphase. Überprüfen Sie nach etwa fünf und zehn Minuten, um sicherzustellen, dass der Fokus beibehalten wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, versuchen Sie, den Fokus unmittelbar nach dem Abgleich des nächsten Bildes anzupassen.Speichern Sie die Datei unmittelbar nach Abschluss der Anlagenphase. Öffnen Sie dann sowohl grüne als auch orange Seitengmuschelventile, während Sie beide Befestigungskolbenventile schließen. Achten Sie darauf, die Bühne nicht zu stoßen, wenn sich Ventile in der Inkubationskammer befinden.Ziehen Sie die Thermometersonde ab, und ersetzen Sie den Befestigungskolben durch den Wachstumskolben. Konfigurieren Sie nun die Software so, dass sie alle 15 Minuten über 22 Stunden ein Bild abruft, und beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Wachstumsphase. Sobald die Erfassung der Wachstumsphase abgeschlossen ist und die Datei gespeichert wurde, öffnen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungskolbenventile, die ein Geräusch machen können, wenn der Druck auf der orangen Seite abgibt.Ziehen Sie auf den grünen Seitenschläuchen, die von beiden Medienkolben kommen, bis sie mindestens mehrere Zentimeter über den Medien liegen. Führen Sie dann die Pumpe mit hoher Geschwindigkeit aus, um alle Medien aus dem Schlauch zu entfernen, was die Reinigung erheblich erleichtert. Schließlich quantifizieren Sie die Videos, wie im Textprotokoll beschrieben.Dieses Zeitraffer-Dunkelfeldmikroskopie-Video zeigt die Befestigung von Wild-Candida-Albican-Zellen an den Substratunterlauf während der Anhaftungsphase, gefolgt von dem anschließenden Wachstum und der Entwicklung während der Wachstumsphase, die zur Biofilmbildung führt. Die Daten aus diesen Videos können für die Raten der Zellanhaftung und Ablösung und Biomasse im Laufe der Zeit analysiert werden, hier zeigt die gesamte Biomasse innerhalb des Bildgebungsbereichs, die durch densitometrie-Analyse bestimmt wird. Die kumulative Rate der Zellanhaftung und die prozentuale Biomasseablösung im Laufe der Zeit werden ebenfalls angezeigt.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die gleichen bildgebenden Bedingungen für alle Experimente zu verwenden, da dies quantitative Vergleiche zwischen ihnen ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entwicklung eines Negativ Selektionsmarker für Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...