Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

लेखकों के प्रवाह तंत्र के डिजाइन में मूल्यवान इनपुट प्रदान करने के लिए डॉ वेड Sigurdson स्वीकार करना चाहते हैं ।

1. प्रवाह तंत्र को इकट्ठा
<ol><li>configure सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध के अनुसार चित्रा 1 में विचार के साथ नीचे चर्चा के साथ भागों । ध्यान दें: सुविधा के लिए, प्रवाह तंत्र दो पक्षों में विभाजि...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर के रूप में ऊपर उल्लिखित मात्रात्मक समय कवक के फिल्म विकास और विकास के चूक वीडियो की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । प्रयोगों के बीच तुलना के लिए अनुमति देने के लिए यह महत्वपूर्ण...

Candida albicans (सी. albicans) मनुष्यों की एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ है कि मौखिक श्लैष्मिक सतहों सहित कई प्रकार के ऊतकों को संक्रमित कर सकते हैं, oropharyngeal कैंडिडिआसिस के कारण और प्रभावित व्यक्तियों के लिए जीवन की एक कम गुणवत्ता में जिसके परिणामस्वरूप1। फिल्म गठन सी albicansके रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है, और कई अध्ययनों के गठन और c. albicans के समारोह पर किया गया है2,3,4, 5, जिनमें से कई स्थैतिक का उपयोग कर आयोजित किया गया है (कोई प्रवाह) इन विट्रो मॉडल । हालांकि, C. albicans पालन और मौखिक गुहा में लार प्रवाह की उपस्थिति में विकसित करना चाहिए । कई प्रवाह प्रणालियों के लिए लाइव सेल इमेजिंग6,7,8,9,10के लिए अनुमति विकसित किया गया है । इन विभिंन प्रवाह प्रणालियों विभिंन प्रयोजनों के लिए डिजाइन किया गया है, और इसलिए प्रत्येक प्रणाली अलग शक्तियों और कमजोरियों है । हमने पाया है कि albicans के लिए उपयुक्त प्रवाह प्रणालियों के कई महंगे थे, आवश्यक परिसर गढ़े भागों, या प्रवाह के दौरान छवि नहीं किया जा सकता है और इमेजिंग करने से पहले बंद कर दिया था । इसलिए, हम प्रवाह11के अंतर्गत C. albicans फिल्म गठन का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास प्रवाह तंत्र विकसित की है । हमारे प्रवाह तंत्र के डिजाइन के दौरान, हम इन प्रमुख बातों का पालन किया । सबसे पहले, हम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता के बिना (हमें उत्परिवर्ती उपभेदों और unmodified नैदानिक आसानी से अलग से अध्ययन करने की अनुमति) के लिए वास्तविक समय में फिल्म के विकास और विकास के कई पहलुओं को मात्रा में सक्षम होना चाहता था । दूसरा, हम सभी भागों चाहता था कि कोई संशोधनों को थोड़ा के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो (यानी, कोई कस्टम निर्माण), दूसरों को और अधिक आसानी से हमारी प्रणाली विश्राम की अनुमति है, और आसान मरंमत के लिए अनुमति दी । तीसरा, हम भी काफी उच्च प्रवाह दर पर विस्तारित इमेजिंग बार के लिए अनुमति देना चाहता था । अंत में, हम चाहते थे, प्रवाह के तहत सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न कोशिकाओं की अवधि के बाद, नई कोशिकाओं को शुरू करने के बिना एक विस्तारित समय पर फिल्म विकास की निगरानी करने में सक्षम हो.
इन बातों का नेतृत्व हमें दो विकसित करने के लिए-कुप्पी पुनर्संचारी प्रवाह प्रणाली 1 चित्रामें सचित्र । दो कुप्पी हम दो चरणों में प्रयोग विभाजित करने के लिए अनुमति देते हैं, एक लगाव चरण है कि सेल से ड्रॉ-वरीयता प्राप्त लगाव कुप्पी, और एक विकास चरण है कि सेल मुक्त मीडिया का उपयोग करता है के लिए नई कोशिकाओं के अलावा बिना फिल्म विकास जारी है । इस प्रणाली को माइक्रोस्कोप के लिए एक मशीन चैंबर के साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, स्लाइड के साथ और यह पूर्ववर्ती टयूबिंग (2 से 5, चित्रा 1) मशीन के अंदर रखा जा रहा है, और अंय सभी घटकों के बाहर एक बड़े माध्यमिक कंटेनर में रखा माइक्रोस्कोप. इसके अतिरिक्त, एक संलग्न तापमान जांच के साथ एक चूल्हा सरगर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगाव कुप्पी में कवक कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । के रूप में यह पुनर्संचारी है, इस प्रणाली के प्रवाह के दौरान सतत इमेजिंग में सक्षम है (३६ से अधिक हो सकता है एच शर्तों के आधार पर), और सबसे मानक सूक्ष्मदर्शी, ईमानदार या उल्टे benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित पर इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम विधानसभा, संचालन पर चर्चा, और प्रवाह तंत्र की सफाई, साथ ही साथ कुछ बुनियादी ImageJ मात्रात्मक एल्गोरिदम प्रदान करने के लिए एक प्रयोग के बाद वीडियो का विश्लेषण ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

oropharyngeal कैंडिडिआसिस में, जीनस Candida के सदस्यों और मौखिक श्लैष्मिक सतह पर बढ़ने का पालन करना चाहिए, जबकि लार प्रवाह के प्रभाव के तहत । जबकि प्रवाह के तहत विकास के लिए मॉडल विकसित किया गया है, इन प्रणालियों के कई महंगे हैं, या इमेजिंग की अनुमति नहीं है जबकि कोशिकाओं के प्रवाह के तहत कर रहे हैं । हम एक उपंयास तंत्र है कि हमें छवि के विकास और प्रवाह के तहत Candida albicans कोशिकाओं के विकसित करने के लिए और वास्तविक समय में अनुमति देता है विकास किया है । यहां, हम विधानसभा और इस प्रवाह तंत्र के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल विस्तार, साथ ही साथ डेटा उत्पंन कर रहे है कि ठहराव । हम दरों है कि कोशिकाओं को देते है और स्लाइड से अलग है, साथ ही समय के साथ स्लाइड पर बायोमास का एक उपाय निर्धारित करने में सक्षम हैं । इस प्रणाली दोनों किफायती और बहुमुखी, सस्ती benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के कई प्रकार के साथ काम कर रहा है, और विस्तारित इमेजिंग समय के अंय प्रवाह प्रणालियों की तुलना में सक्षम है । कुल मिलाकर, इस प्रवाह के तहत कवक प्रजातियों के उच्च फिल्म विकास पर अत्यधिक विस्तृत वास्तविक समय की जानकारी प्रदान कर सकते है कि एक कम प्रवाह प्रणाली है ।

एक सामांय रात भर समय चूक प्रयोग के प्रतिनिधि छवियां ३७ डिग्री सेल्सियस पर वंय-प्रकार C. albicans कोशिकाओं का उपयोग चित्रा 2एक और पूरक वीडियो 1में देखा जा सकता है । छवियो?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

हम विधानसभा, संचालन का वर्णन है, और प्रवाह के तहत, जबकि वास्तविक समय में छवि कवक फिल्म गठन के लिए डिजाइन एक तंत्र की सफाई । हम भी प्रदान करते है और मात्रात्मक एल्गोरिदम पर चर्चा का अधिग्रहण छवियों पर इस्तेमाल किया जाएगा ।

रीयल-टाइम इमेजिंग और फंगल ठहराव के विकास की एक दो चरण के पुनर्संचारित प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

यह विधि माइक्रोबायोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि कैसे द्रव प्रवाह फंगल बायोफिल्म विकास और विकास को बदल देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें वास्तविक समय में बायोफिल्म विकास और विकास पर प्रवाह के प्रभावों का मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित प्रवाह तंत्र की असेंबली के साथ इस प्रयोग को शुरू करें।प्रयोग के दिन, बुलबुला जाल, तापमान जांच, और सभी एकल उपयोग घटकों को संलग्न करें। फिल्टर को इकट्ठा करने के लिए, इसे एडाप्टर बनाने के लिए एक मिलीलीटर सिरिंज से प्लंजर को हटा दें। फिल्टर बोतल से ट्यूबिंग को इस अंत में मजबूर करें और टयूबिंग में 2 माइक्रोन फिल्टर संलग्न करें जिससे विकास फ्लास्क हो।इसे जोड़ने से पहले स्लाइड एडाप्टर के कंटिया के चारों ओर सिलिकॉन वैक्यूम तेल लागू करें, क्योंकि यह सिस्टम में हवा लीक को रोकने में मदद करता है। वाईपीडी के 100 मिलीलीटर के साथ अटैचमेंट फ्लास्क भरें, और वाईपीडी के 200 मिलीलीटर के साथ विकास फ्लास्क भरें। सुनिश्चित करें कि हरे रंग की ओर टयूबिंग प्रत्येक फ्लास्क में मीडिया तक पहुंचता है।सुनिश्चित करें कि सभी वाल्व खुले हैं। एक वैक्यूम करने के लिए बुलबुला जाल देते हैं, और बुलबुला जाल के नीचे की ओर हरे रंग की ओर टयूबिंग करने के लिए पंप कनेक्ट। तरल पदार्थ को पूरी तरह से हरे रंग की ओर भरने के लिए प्रति मिनट 3.3 मिलीलीटर की प्रवाह दर पर पंप करें।फिर, मीडिया के लगभग एक से दो मिलीलीटर को बांटना और त्यागना, क्योंकि मिलीलीटर के पहले जोड़े में अक्सर मृत कोशिकाएं या यादृच्छिक मलबे होते हैं। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग के हरे रंग की ओर मीडिया से भर जाता है और आगे बढ़ने से पहले बुलबुला जाल के नीचे कोई बुलबुले है। चैनल स्लाइड और YPD के साथ जलाशय भरें, बुलबुले शुरू करने के लिए नहीं ध्यान रखते हुए ।स्लाइड को प्रवाह तंत्र से जोड़ें। फिर नारंगी पक्ष पर लगभग 5 मीटर का बफर बनाने के लिए अधिक तरल पदार्थ पंप करें। यह बैकफ्लो की स्थिति में स्लाइड में गलती से हवा फंसाने से रोकने के लिए है।अब, पहले बुलबुला जाल के इनलेट और आउटलेट को बंद करके माइक्रोस्कोप तक परिवहन के लिए प्रवाह उपकरण तैयार करें। फिर हरे और नारंगी पक्ष लगाव फ्लास्क वाल्व बंद दबाना। सुनिश्चित करें कि स्पंदन डैम्पर और फिल्टर बोतल के लिए स्क्रू कैप तंग हैं, क्योंकि वे ऑटोप्लेटिंग के दौरान ढीला कर सकते हैं।परिवहन को आसान बनाने के लिए पंप को ट्यूबिंग से डिस्कनेक्ट करें। फिर गर्म प्लेट स्टरर सहित सभी घटकों को माइक्रोस्कोप के पास एक माध्यमिक कंटेनर में ले जाएं। गर्म थाली उभारने के लिए तापमान जांच देते हैं, और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए लगाव फ्लास्क हीटिंग शुरू करते हैं ।300 आरपीएम पर मीडिया हिलाओ, और पूरे प्रयोग के लिए इस बनाए रखने. माइक्रोस्कोप पर स्लाइड माउंट, और यदि आवश्यक हो तो इसे कसकर सुरक्षित करने के लिए टेप का उपयोग करें। फिर बुलबुले जाल को वैक्यूम से जोड़ दें।अब पंप को फ्लो उपकरण से जोड़ें। प्रति मिनट 3.3 मिलीलीटर की प्रवाह दर पर पंप शुरू करें, और इसे लगभग पांच से 10 सेकंड तक चलाने की अनुमति दें। फिर, चलो बाहर ढक्कन कबीले में बुलबुला जाल हटा दें।पंप को चलने की अनुमति दें, जबकि लगाव फ्लास्क गरमा । एक बार लगाव फ्लास्क और इनक्यूबेशन चैंबर दोनों ३७ डिग्री सेल्सियस पर हैं, लगाव कुप्पी के लिए कवक कोशिकाओं की पर्याप्त रातोंरात संस्कृति जोड़ने के लिए मिलीलीटर प्रति १,०,० कोशिकाओं तक पहुंचने । कोशिकाओं को स्वीकार करने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें।कोशिकाओं के प्रवाह को शुरू करने के लिए दोनों विकास फ्लास्क वाल्व को बंद करते हुए हरे और नारंगी पक्ष अटैचमेंट फ्लास्क वाल्व दोनों खोलें। कोशिकाओं को स्लाइड तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए लगभग पांच मिनट तक प्रतीक्षा करें। इस समय के दौरान, माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें और इसे पिछले प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले उन्हीं इमेजिंग मापदंडों में समायोजित करें।कुर्की चरण के लिए छवि अधिग्रहण शुरू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए लगभग पांच और 10 मिनट के बाद वापस देखें कि ध्यान बनाए रखा गया है। यदि नहीं, तो अगली छवि के अधिग्रहण के तुरंत बाद ध्यान समायोजित करने का प्रयास करें।कुर्की चरण समाप्त होने के तुरंत बाद, फ़ाइल को सहेजें। फिर दोनों लगाव फ्लास्क वाल्व बंद करते हुए हरे और नारंगी पक्ष के विकास फ्लास्क वाल्व दोनों खोलें। यदि कोई वाल्व इनक्यूबेशन कक्ष के अंदर हैं तो मंच को टक्कर न दें।थर्मामीटर जांच को अनप्लग करें, और लगाव फ्लास्क को विकास फ्लास्क से बदलें। अब, 22 घंटे से अधिक हर 15 मिनट में एक छवि प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर को कॉन्फ़िगर करें, और विकास चरण के लिए छवि अधिग्रहण शुरू करें। एक बार विकास चरण अधिग्रहण समाप्त हो गया है और फ़ाइल को बचाया गया है, हरे और नारंगी पक्ष लगाव फ्लास्क वाल्व, जो नारंगी पक्ष पर दबाव विज्ञप्ति के रूप में एक शोर कर सकते है खुला ।दोनों मीडिया फ्लास्क से आने वाले हरे रंग की ओर टयूबिंग पर खींचें, जब तक कि वे मीडिया से कम से कम कई सेंटीमीटर न हों। इसके बाद सभी मीडिया को टयूबिंग से हटाने के लिए पंप को तेज गति से चलाएं, जिससे सफाई काफी आसान हो जाती है। अंत में, पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित वीडियो की मात्रा निर्धारित करें।इस बार चूक डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी वीडियो से पता चलता है कि अटैचमेंट चरण के दौरान सब्सट्रेट अंडरफ्लो के लिए जंगली प्रकार कैंडिडा एल्बिकन कोशिकाओं का लगाव, इसके बाद विकास चरण के दौरान बाद में विकास और विकास के कारण बायोफिल्म गठन होता है। इन वीडियो से डेटा समय के साथ सेल लगाव और टुकड़ी और बायोमास की दरों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, यहां दिखाया गया है इमेजिंग क्षेत्र के भीतर कुल बायोमास के रूप में घनत्व विश्लेषण द्वारा निर्धारित है । समय के साथ सेल अटैचमेंट की संचयी दर और प्रतिशत बायोमास टुकड़ी भी दिखाई जाती है ।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, सभी प्रयोगों में एक ही इमेजिंग स्थितियों का उपयोग करना याद रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह मात्रात्मक तुलना के लिए उनके बीच किए जाने की अनुमति देता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Leukotriene बी के वास्तविक समय इमेजिंग 4 मध्यस्थता सेल प्रवासन और β-arrestin साथ BLT1 सहभागिता

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas और प्रवाह कक्ष में Saccharomyces cerevisiae Biofilm aeruginosa

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

एक नकारात्मक के लिए चयन मार्कर का विकास एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

वास्तविक समय, TCR के साथ - साथ इमेजिंग और उसके एसोसिएटेड संकेतन प्रोटीन के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोपी तकनीक

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन के तहत शारीरिक प्रवाह के दौरान Endothelial सेल सेल जंक्शनों के वास्तविक समय इमेजिंग

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilm विकास पर थूक के प्रभाव Visualizing एक संभाग coverglass मॉडल का उपयोग

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

इमेजिंग प्रवाह Cytometry का उपयोग कर मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा Synapse के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...