Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Gli autori desidera ringraziare Dr. Wade Sigurdson per fornire un input prezioso nella progettazione dell'apparato di flusso.

1. Montare l'apparecchiatura di flusso
<ol><li>Configurare le parti elencate nella Tabella materiali seguendo lo schema in Figura 1 con le considerazioni discussione di seguito. Nota: Per comodità, il flusso apparato è diviso in due lati, il lato verde (tutto a Monte della diapositiva per le beute di media) e l'arancio lato (tutto a valle della diapositiva per le beute di media).<ol>
<li>Garantire che tutto l'apparato di flusso è aria stretta per evitare perdite, con...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Utilizzando il sistema di flusso come indicato in precedenza consente la generazione di video time-lapse quantitativi della crescita di biofilm fungine e dello sviluppo. Per consentire il confronto tra esperimenti è di importanza critica per garantire che i parametri di imaging vengono mantenuti lo stesso. Ciò include garantire che il microscopio è impostato per l'illuminazione di Köhler per ogni esperimento (molte guide sono disponibili online per questo processo). Oltre a parametri di imaging, ci sono alcuni passi ...

Candida albicans (C. albicans) è un agente patogeno fungoso opportunistico degli esseri umani che possono infettare molti tipi di tessuto, comprese le superfici mucose orale, causando la candidosi orofaringea e conseguente a una minore qualità della vita per individui affetti1. Formazione di biofilm è una caratteristica importante per la patogenesi di albicans del c., e numerosi studi sono stati fatti sulla formazione e sulla funzione di c. albicans biofilms2,3,4, 5, molti dei quali sono stati eseguiti utilizzando statico (nessun flusso) in vitro modelli. Tuttavia, c. albicans deve aderire e crescere in presenza di flusso salivare nella cavità orale. Numerosi sistemi di flusso sono stati sviluppati per consentire per vivere-cella imaging6,7,8,9,10. Questi sistemi di flusso differenti sono stati progettati per scopi diversi, e quindi ogni sistema ha diversi punti di forza e debolezze. Abbiamo trovato che molti del flusso sistemi appropriati per albicans del c. erano costose, richiesto complesso fabbricato parti, o non potrebbe essere imaged durante flusso e doveva essere fermato prima di formazione immagine. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un apparato di flusso romanzo per studiare la formazione di biofilm di albicans del c. sotto flusso11. Durante la progettazione del nostro apparato di flusso, abbiamo seguito queste considerazioni principali. In primo luogo, abbiamo voluto essere in grado di quantificare gli aspetti multipli della crescita di biofilm e sviluppo in tempo reale senza richiedere l'uso di cellule fluorescenti (permettendoci di ceppi mutanti di studio e gli isolati clinici non modificati facilmente). In secondo luogo, volevamo tutte le parti per essere commercialmente disponibile con poca o nessuna modifica (cioè., nessun montaggio su ordinazione), consentendo ad altri di più facilmente ricreare il nostro sistema e per riparazioni semplici. In terzo luogo, abbiamo anche voluto consentire per esteso volte al prezzo ragionevolmente elevato flusso di imaging. Infine, abbiamo voluto, dopo un periodo di cellule allegare al substrato sotto flusso, essere in grado di monitorare la crescita di biofilm nel corso di un periodo prolungato senza introdurre nuove cellule.
Queste considerazioni hanno portato a sviluppare il sistema di flusso a ricircolo due-boccetta illustrato nella Figura 1. Due boccette ci permettono di dividere l'esperimento in due fasi, una fase di attaccamento che attinge il matraccio di cella-seminato allegato e una fase di crescita che utilizza mezzi senza cellula per continuare la crescita di biofilm senza l'aggiunta di nuove cellule. Questo sistema è progettato per funzionare con una camera di incubazione per il microscopio, con lo scivolo e il tubo che lo precede (2 a 5, Figura 1) essere collocato all'interno dell'incubatore, e tutti gli altri componenti collocati in un grande contenitore secondario di fuori del microscopio. Inoltre, un agitatore di piastra riscaldante con una sonda di temperatura collegata viene utilizzato per mantenere le cellule fungine nella beuta di attaccamento a 37 ° C. Come esso è a ricircolo, questo sistema è in grado di imaging continuo durante il flusso (può essere oltre 36 h a seconda di condizioni) e può essere utilizzato sulla maggior parte dei microscopi, tra cui microscopi da banco verticale o invertito. Qui, discutiamo l'assembly, operazione, e pulizia dell'apparato di flusso, oltre a fornire alcuni algoritmi quantitativi di base ImageJ per analizzare i video dopo un esperimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

Nella candidosi orofaringea, membri del genere Candida devono rispettare e crescere sulla superficie mucosa orale mentre sotto gli effetti del flusso salivare. Mentre sono stati sviluppati modelli per la crescita sotto flusso, molti di questi sistemi sono costosi, o non consentire mentre le cellule sono sotto flusso di imaging. Abbiamo sviluppato un apparato romanzo che ci permette di immagine la crescita e lo sviluppo delle cellule di Candida albicans in flusso e in tempo reale. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per il montaggio e l'uso di questo apparato di flusso, così come la quantificazione dei dati generati. Siamo in grado di quantificare le tariffe che le cellule collegare e staccano dalla diapositiva, come pure di determinare una misura della biomassa sulla diapositiva nel corso del tempo. Questo sistema sia economico e versatile, lavorando con molti tipi di microscopi ottici, compresi microscopi benchtop poco costoso, ed è in grado di estesa volte rispetto ad altri sistemi di flusso di imaging. Nel complesso, questo è un sistema di bassa produttività che può fornire informazioni in tempo reale altamente dettagliate sulla crescita di biofilm delle specie fungine sotto flusso.

Immagini rappresentative di un normale pernottamento time-lapse esperimento utilizzando selvaggio-tipo albicans del c. le cellule a 37 ° C possono essere visto in Figura 2A e supplementare Video 1. Le immagini sono state contrasto aumentato per migliorare la visibilità. Quantificazione dei dati originali è stato effettuato, e grafici rappresentativi possono essere visto in Figura 2<st...

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Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come il modo in cui il flusso di fluido altera la crescita e lo sviluppo del biofilm fungino. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di valutare quantitativamente gli effetti del flusso sulla crescita e lo sviluppo del biofilm in tempo reale. Iniziate questo esperimento con l'assemblaggio dell'apparato di flusso, come descritto nel protocollo di testo.Il giorno dell'esperimento, attaccare la trappola a bolle, la sonda di temperatura e tutti i componenti a uso singolo. Per assemblare il filtro, rimuovere lo stantuffo da una siringa da un millilitro per renderlo un adattatore. Forzare il tubo dal flacone filtrante a questa estremità e attaccare un filtro da 2 micron al tubo che porta al pallone di crescita.Applicare grasso sottovuoto in silicone intorno alla spina dell'adattatore di scorrimento prima di collegarlo, in quanto ciò aiuta a prevenire perdite d'aria nel sistema. Riempire il pallone di fissaggio con 100 millilitri di YPD e riempire il pallone in crescita con 200 millilitri di YPD. Assicurarsi che il tubo laterale verde raggiunga il supporto in ogni pallone.Assicurarsi che tutte le valvole siano aperte. Attaccare la trappola a bolle a un vuoto e collegare la pompa al tubo laterale verde a valle della trappola a bolle. Pompare il fluido a una portata di 3,3 millilitri al minuto per riempire completamente il lato verde.Quindi, erogare e scartare circa uno o due millilitri del supporto, perché i primi due millilitri spesso contengono cellule morte o detriti casuali. Assicurarsi che il lato verde del tubo sia riempito di supporti e non abbia bolle a valle della trappola a bolle prima di procedere. Riempire lo scivolo del canale e il serbatoio con YPD, facendo attenzione a non introdurre bolle.Collegare la diapositiva all'apparato di flusso. Quindi pompare più fluido per creare un tampone di circa 5 metri sul lato arancione. Questo per evitare di intrappolare accidentalmente l'aria nello scivolo in caso di riflusso.Ora, preparare l'apparato di flusso per il trasporto al microscopio piantando prima l'ingresso e l'uscita della trappola a bolle chiusa. Quindi bloccare le valvole del pallone di fissaggio laterali verdi e arancioni chiuse. Assicurarsi che i tappi a vite per lo smorzatore di pulsazione e il flacone del filtro siano stretti, in quanto possono allentare durante la placcatura automatica.Scollegare la pompa dal tubo per facilitare il trasporto. Quindi spostare tutti i componenti, incluso l'agitatore a piastra calda, in un contenitore secondario vicino al microscopio. Attaccare la sonda di temperatura all'agitatore a piastra calda e iniziare a riscaldare il pallone di fissaggio a 37 gradi Celsius.Mescolare il supporto a 300 giri/min e mantenerlo per l'intero esperimento. Montare la diapositiva al microscopio e, se necessario, utilizzare il nastro adesivo per fissarla saldamente. Quindi attaccare la trappola a bolle a un vuoto.Ora, collegare la pompa all'apparato di flusso. Avviare la pompa a una portata di 3,3 millilitri al minuto e consentirgli di funzionare per circa cinque-10 secondi. Quindi, rimuovi la trappola per bolle nel clan dei coperchi let-out.Lasciare che la pompa continui a funzionare mentre il pallone di fissaggio si riscalda. Una volta che il pallone di fissaggio e la camera di incubazione sono entrambi a 37 gradi Celsius, aggiungere abbastanza coltura notturna delle cellule fungine al pallone di fissaggio per raggiungere un milione di cellule per millilitro. Attendere 15 minuti per consentire alle celle di acclimatarsi.Aprire le valvole del pallone di fissaggio laterali sia verdi che arancioni chiudendo entrambe le valvole del pallone di crescita per avviare il flusso delle celle. Attendere circa cinque minuti per consentire alle celle di raggiungere la diapositiva. Durante questo periodo, focalizzare il microscopio e regolarlo agli stessi parametri di imaging utilizzati negli esperimenti precedenti.Iniziare l'acquisizione dell'immagine per la fase di attacco. Controllare dopo circa cinque e 10 minuti per assicurarsi che la messa a fuoco sia stata mantenuta. In caso meno, prova a regolare lo stato attivo immediatamente dopo l'acquisizione dell'immagine successiva.Immediatamente dopo il termine della fase di attacco, salvare il file. Quindi aprire le valvole del pallone di crescita lato verde e arancione chiudendo entrambe le valvole del pallone di fissaggio. Fare attenzione a non urtare il palco se alcune valvole si trovano all'interno della camera di incubazione.Scollegare la sonda termometrica e sostituire il pallone di fissaggio con il pallone di crescita. Ora, configura il software per acquisire un'immagine ogni 15 minuti in 22 ore e inizia l'acquisizione di immagini per la fase di crescita. Una volta terminata l'acquisizione della fase di crescita e salvato il file, aprire le valvole di fissaggio laterali verdi e arancioni, che possono fare rumore quando la pressione si rilascia sul lato arancione.Tirare su sui tubi laterali verdi provenienti da entrambi i contenitori multimediali, fino a quando non sono almeno diversi centimetri sopra il supporto. Quindi, far funzionare la pompa ad alta velocità per rimuovere tutti i supporti dal tubo, il che rende la pulizia molto più semplice. Infine, quantifica i video come descritto nel protocollo di testo.Questo video di microscopia a campo scuro time lapse mostra l'attaccamento di cellule albican di tipo selvaggio Candida al sottoflusso del substrato durante la fase di attacco, seguito dalla successiva crescita e sviluppo durante la fase di crescita che porta alla formazione di biofilm. I dati di questi video possono essere analizzati per i tassi di attacco cellulare e distacco e biomassa nel tempo, mostrati qui è la biomassa totale all'interno della regione di imaging come determinato dall'analisi densitometrica. Vengono mostrati anche il tasso cumulativo di attacco cellulare e la percentuale di distacco della biomassa nel tempo.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le stesse condizioni di imaging in tutti gli esperimenti, in quanto ciò consente di effettuare confronti quantitativi tra di essi.

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Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...