Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

著者は、フロー装置の設計の貴重な入力を提供するため博士ウェイド Sigurdson を認めたいと思います。

1. フロー装置を組み立てる
<ol><li>後述の考慮事項と図 1の回路図によると材料表に掲げる部品を構成します。 注意: 便宜上、装置は 2 つの側面、(上流のすべてメディア フラスコにスライド)、緑の側とオレンジ色に分かれて流れ側 (下流のすべてメディア フラスコにスライド)。<ol>
<li>フロー装置のすべてがメディア フラスコ (図 1,...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. 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上記できますフロー システムを使用して菌のバイオ フィルムの成長と発展の定量的な時間経過のビデオを生成。実験間の比較を可能にするイメージングのパラメーターが同じに保たれることを確保するため非常に重要です。これは (多くのガイドは、利用可能なオンラインこのプロセス) 各実験用ケーラー照明が顕微鏡に設定されていることを確認含まれています。パラメーターをイメージ?...

カンジダ ・ アルビカンス(C. albicans) は、口腔粘膜の表面、口腔咽頭カンジダ症の原因、影響を受けた個人1生命の低品質の結果など、多くの組織タイプに感染する人間の日和見病原菌です。C. アルビカンスの病因の重要な特徴であり、形成とC. albicansバイオ フィルム2,3,4の機能に関する多くの研究が行われているバイオ フィルム形成 5、体外静的 (ない流れ) を使用して多くを行ったモデル。ただし、 C. albicans必要がある、口腔内の唾液の存在下で成長します。多数のフロー システムは、生細胞イメージング6,7,8,9,10を許可するように開発されています。これらの異なった流れシステムは異なる目的のために設計されている、従って各システムに異なる長所と短所。C. albicansの適切なシステムの流れの多くは高価でした、必要な複雑な加工、または流れの中のイメージを作成およびできなかった画像の前に停止しなければならなかったことがわかった。そこで、流れ11下C. albicansのバイオ フィルム形成を研究する新しいフロー装置。私たちフロー装置の設計時にこれらの主要な考慮事項に従いました。まず、バイオ フィルムの成長と開発の複数の側面を定量化することができるしたい (ように私たち研究変異株と変更されていない臨床分離株簡単に) 蛍光セルの使用を必要とすることがなく、リアルタイム。第二に、すべてのパーツを少し変更なしで市販したい (すなわち。、ないカスタム作製)、他よりは簡単に私たちのシステムを再作成できるように、簡単な修理を可能にします。拡張のための許可したいもの第三に、合理的に高流量時の画像します。最後に、たい、流れ、下基板に取り付けるセルの期間に続く新しい細胞を導入することがなく長期間バイオ フィルムの成長を監視することができます。
これらの考慮事項は、図 1に示す 2 フラスコ循環フロー システムを開発する私たちを率いてください。2 つのフラスコでは、2 つのフェーズ、添付ファイルのセル シード フラスコから描画する添付ファイル相、新しいセルを追加することがなくバイオ フィルムの成長を継続する無細胞系メディアを使用する成長期に実験を分割させてください。このシステムは、スライドとチューブ (5 に 2図 1) が、孵化器の中に置かれていることの前の顕微鏡用培養室で動作するように設計されています、外大セカンダリ コンテナーに配置するその他のコンポーネントはすべて、顕微鏡。また、接続された温度プローブとホット プレート攪拌 37 ° C で添付ファイル フラスコの真菌細胞を維持するために使用されます。それは再循環、このシステム フロー (36 h 以上の条件に応じてすることができます)、中に連続的なイメージングが可能です、直立または反転卓上顕微鏡を含む最も標準的な顕微鏡に使用できます。ここでは、アセンブリの操作、しフロー装置のクリーニング同様としては実験後、ビデオを分析するいくつかの基本的な ImageJ 定量的アルゴリズムを提供.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

口腔咽頭カンジダ症は、カンジダ属のメンバーする必要がありますに付着し、唾液の影響下で口腔粘膜表面上に成長します。流れ下で成長のためのモデルを開発しているが、これらのシステムの多くは高価で、またはセルが流下しながら画像を許可しません。成長とカンジダ細胞の流れの下で、リアルタイムでの発展をイメージすることができます新しい装置を開発しました。ここでは、アセンブリと、この装置の使用だけでなく、生成されるデータの定量化のプロトコルを詳しく説明します。セルにアタッチとデタッチ スライドからも時間をかけてスライド上のバイオマスの測定を確認するに料金を定量化することが。このシステムは経済的で汎用性の高い、安価な卓上顕微鏡を含む光の顕微鏡の多くの種類を扱う、他フロー システムに比べて倍のイメージングができる拡張します。全体的にみて、流動場下における真菌種のバイオ フィルムの成長に非常に詳細なリアルタイムの情報を提供することができます低スループット システムです。

通常の代表的な画像がコマ撮り実験を一晩野生型c. アルビカンスを使用してその 37 ° C でセルを図 2Aおよび補足のビデオ 1で見ることができます。画像は見やすくするために造影されています。元のデータの定量化を行ったと代表的なグラフが図 2Bで見ることができます。(す...

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Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

アセンブリ操作について述べる、流下しながらリアルタイムで画像菌バイオ フィルム形成に設計フロー装置のクリーニングします。我々 はまた、提供し、取得した画像に使用する定量的アルゴリズムを話し合います。

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

この方法は、流体の流れが真菌バイオフィルムの成長と発達をどのように変化させるかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、リアルタイムでのバイオフィルムの成長と開発に対する流れの影響を定量的に評価できることです。テキストプロトコルに記載されているように、フロー装置の組み立てからこの実験を開始する。実験の日は、バブルトラップ、温度プローブ、およびすべての単一使用部品を取り付けます。フィルターを組み立てるには、1 ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外してアダプターにします。フィルターボトルからこの端にチューブを無理に取り付け、成長フラスコにつながるチューブに2ミクロンフィルターを取り付けます。スライドアダプタのバーブの周りにシリコーン真空グリースを塗布して接続します。100ミリリットルのYPDで付着フラスコを充填し、成長フラスコに200ミリリットルのYPDを充填します。緑の側のチューブが各フラスコのメディアに届くよう確認します。すべてのバルブが開いていることを確認します。バブルトラップを真空に取り付け、ポンプをバブルトラップの下流にある緑の側のチューブに接続します。1分間に3.3ミリリットルの流量で流体をポンプで送り、グリーン側を完全に満たします。次に、最初の数ミリリットルが死んだ細胞またはランダムな破片を含むことが多いため、培地の約1〜2ミリリットルを分配して廃棄する。先に進む前に、チューブの緑色の側がメディアで満たされ、バブルトラップの下流に泡がないことを確認してください。チャネルスライドとリザーバをYPDで満たし、気泡を導入しないように注意してください。スライドをフロー装置に接続します。その後、オレンジ側に約5メートルのバッファを作成するために、より多くの流体をポンプ。これは、バックフローが発生した場合にスライド内の空気を誤ってトラップすることを防ぐためです。ここで、まず気泡トラップの入口と出口を閉じて植えて顕微鏡に搬送するための流量装置を用意する。次に、緑とオレンジの側面の取り付けフラスコバルブを閉じます。脈動ダンパーとフィルターボトルのネジキャップが、自動めっき中に緩む可能性があるため、しっかりと固定されていることを確認します。輸送を容易にするためにチューブからポンプを取り外します。次に、ホットプレートスターラーを含むすべてのコンポーネントを顕微鏡の近くの二次容器に移動します。温度プローブをホットプレートスターラーに取り付け、付着フラスコを摂氏37度に加熱し始めます。300 RPM でメディアをかき混ぜ、実験全体のためにこれを維持します。スライドを顕微鏡に取り付け、必要に応じてテープを使用してしっかりと固定します。その後、バキュームにバブルトラップを取り付けます。ここで、ポンプを流動装置に接続します。1分間に3.3ミリリットルの流量でポンプを始動させ、約5〜10秒間動かします。その後、手入れのふたの一族でバブルトラップを取り除きます。取り付けフラスコがヒートアップしている間、ポンプの実行を継続させます。付着フラスコとインキュベーションチャンバーの両方が摂氏37度になったら、1ミリリットル当たり100万個の細胞に達するのに十分な一晩の真菌細胞の培養を付着フラスコに加える。細胞が順応できるように15分待ちます。緑色とオレンジの側面の両方の取り付けフラスコバルブを開き、両方の成長フラスコバルブを閉じて細胞の流れを開始します。セルがスライドに到達するまで約 5 分間待ちます。この間、顕微鏡を焦点を合わせ、前の実験で使用したのと同じイメージングパラメータに調整します。添付フェーズのイメージ取得を開始します。約 5 分と 10 分後に再度確認して、フォーカスが維持されていることを確認します。取得していない場合は、次の画像が取得された直後にフォーカスを調整します。添付ファイルのフェーズが終了した直後に、ファイルを保存します。次に、両方のアタッチメントフラスコバルブを閉じながら、緑とオレンジ側の成長フラスコバルブの両方を開きます。インキュベーションチャンバー内にバルブがある場合は、ステージをぶつけないように注意してください。温度計プローブを抜き、付着フラスコを成長フラスコに交換します。次に、22 時間にわたって 15 分ごとにイメージを取得し、成長フェーズのイメージ取得を開始するようにソフトウェアを構成します。成長相の取得が完了し、ファイルが保存されたら、オレンジ側の圧力が放出されると音を立てる可能性のある緑色とオレンジの側面アタッチメントフラスコバルブを開きます。メディアの上に少なくとも数センチメートルになるまで、両方のメディアフラスコから来る緑の側面のチューブを引き上げます。次に、ポンプを高速で実行してチューブからすべてのメディアを取り除き、洗浄がはるかに簡単になります。最後に、テキスト プロトコルで説明されているビデオを定量化します。この時間経過暗視野顕微鏡ビデオは、取り付け段階の間に野生型カンディダ・アルビカン細胞を基質アンダーフローに取り付け、その後の成長および成長過程での増殖および発生をバイオフィルム形成に導く様子を示す。これらのビデオからのデータは、時間の経過に伴う細胞の取り付けおよび剥離およびバイオマスの割合について分析することができ、ここに示されているのは、密度測定分析によって決定される画像領域内の総バイオマスである。時間経過に関する細胞の添付ファイルの累積率とバイオマス剥離率も示されています。この手順を試みる間は、すべての実験で同じイメージング条件を使用することが重要です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

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フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

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