Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Wade Sigurdson para fornecer valioso contributo na concepção do aparato de fluxo.

1. montar o aparelho de fluxo
<ol><li>Configure as partes constantes da Tabela de materiais , de acordo com o esquema na Figura 1 , com as considerações discutidas abaixo. Nota: Para sua conveniência, o fluxo de aparelhos é dividido em dois lados, o lado verde (tudo contra a corrente do slide para os frascos de mídia) e a laranja do lado (tudo a jusante do slide para os frascos de mídia).<ol>
<li>Certifique-se de que todos os aparelhos de fluxo é ar comprimido pa...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Conforme descrito acima usar o sistema de fluxo permite a geração de quantitativos vídeos Time-Lapse de biofilme fungal crescimento e desenvolvimento. Para permitir comparações entre experiências é de fundamental importância para garantir que os parâmetros de imagem são mantidos os mesmos. Isto inclui assegurar que o microscópio é configurado para iluminação de Köhler para cada experimento (muitos guias estão disponíveis on-line para este processo). Além de parâmetros de imagem, existem alguns passos i...

Candida albicans (C. albicans) é um patógeno oportunista fúngico dos seres humanos que podem infectar vários tipos de tecido, incluindo as superfícies da mucosa orais, causando candidíase orofaríngea e resultando em uma baixa qualidade de vida para os indivíduos afetados1. Formação de biofilme é uma característica importante para a patogênese da c. albicans, e numerosos estudos foram feitos sobre a formação e a função de c. albicans biofilms2,3,4, 5, muitas das quais têm sido realizadas usando estática (sem fluxo) em vitro modelos. No entanto, c. albicans deve aderir e crescer na presença de fluxo salivar na cavidade oral. Numerosos sistemas de fluxo foram desenvolvidos para permitir viver-pilha de imagem6,7,8,9,10. Estes sistemas de fluxo diferentes foram projetados para diferentes fins, e, portanto, cada sistema possui diferentes pontos fortes e pontos fracos. Nós achamos que muitos do fluxo de sistemas adequados para c. albicans foram caros, complexo exigido fabricado peças, ou não poderia ser fotografado durante o fluxo e teve que ser interrompido antes da imagem latente. Portanto, desenvolvemos um aparelho novo fluxo para estudar a formação de biofilmes de c. albicans sob fluxo11. Durante o design do nosso aparelho de fluxo, seguimos estas considerações principais. Primeiro, queríamos ser capaz de quantificar os múltiplos aspectos do crescimento do biofilme e desenvolvimento em tempo real, sem exigir o uso de células fluorescentes (permitindo-nos para estudo de cepas mutantes e isolados clínicos não modificados facilmente). Em segundo lugar, queríamos que todas as partes para ser comercialmente disponíveis com pouca ou nenhuma modificação (i. e., sem fabricação personalizada), permitindo que outros para mais facilmente recriar nosso sistema e permitindo a fácil reparação. Em terceiro lugar, queríamos também permitem extensa imagem vezes em taxas de fluxo razoavelmente alta. Por fim, queríamos, após um período de células anexar ao substrato sob fluxo, poder acompanhar o crescimento do biofilme durante um tempo prolongado sem a introdução de novas células.
Estas considerações nos levaram a desenvolver o sistema de recirculação fluxo dois-balão ilustrado na Figura 1. Os dois balões nos permitem dividir a experiência em duas fases, uma fase de fixação que retira o recipiente acessório celular-semeado e uma fase de crescimento que usa mídia sem célula para continuar o crescimento do biofilme sem a adição de novas células. Este sistema é projetado para trabalhar com uma câmara de incubação para o microscópio, com o slide e o tubo de precedê-lo (2 a 5, Figura 1), sendo colocado dentro da incubadora, e todos os outros componentes colocados em um grande recipiente secundário fora do microscópio. Além disso, um agitador de placa de aquecimento com uma sonda de temperatura anexado é usado para manter as células fúngicas no recipiente de apego a 37 ° C. Como ele é de recirculação, este sistema é capaz de imagem contínua durante o fluxo (pode ser mais de 36 h, dependendo de condições) e pode ser usado em microscópios mais padrão, incluindo microscópios de bancada vertical ou invertida. Aqui, vamos discutir a montagem, operação, e limpeza do aparato de fluxo, bem como fornecer alguns algoritmos de ImageJ base quantitativos para analisar os vídeos depois de uma experiência.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

Na candidíase orofaríngea, membros do gênero Candida devem aderir e crescer na superfície da mucosa oral, enquanto sob os efeitos do fluxo salivar. Enquanto foram desenvolvidos modelos para o crescimento sob fluxo, muitos destes sistemas são caros, ou não permita que enquanto as células estão sob fluxo de imagem. Nós desenvolvemos uma novela aparelho que permite o crescimento e desenvolvimento das células de Candida albicans em fluxo e em tempo real da imagem. Aqui, detalhamos o protocolo para a montagem e a utilização deste aparelho de fluxo, bem como a quantificação dos dados que são gerados. Somos capazes de quantificar as taxas que as células anexar e desanexar do slide, bem como a determinar uma medida da biomassa no slide ao longo do tempo. Este sistema é econômico e versátil, trabalhando com vários tipos de microscópios de luz, incluindo microscópios de bancada barata, e é capaz de estendido vezes comparados a outros sistemas de fluxo de imagem. Globalmente, este é um sistema de baixa taxa de transferência que pode fornecer informações em tempo real altamente detalhadas sobre o crescimento de biofilmes de espécies de fungos sob fluxo.

Imagens representativas de um normal durante a noite o lapso de tempo experimento usando o selvagem-tipo c. albicans células a 37 ° C podem ser vistas na Figura 2 e 1 de vídeo suplementar. As imagens foram aprimorado para melhorar a visibilidade de contraste. Realizou-se a quantificação dos dados originais e gráficos representativos podem ser vistos na Figura 2B. P...

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Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como como o fluxo de fluidos altera o crescimento e o desenvolvimento de biofilme fúngicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite avaliar quantitativamente os efeitos do fluxo no crescimento e desenvolvimento de biofilme em tempo real. Inicie este experimento com a montagem do aparelho de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.No dia do experimento, conecte a armadilha da bolha, a sonda de temperatura e todos os componentes de uso único. Para montar o filtro, remova o êmbolo de uma seringa de um mililitro para torná-lo um adaptador. Force a tubulação da garrafa do filtro para esta extremidade e conecte um filtro de 2 mícrons ao tubo que leva ao frasco de crescimento.Aplique graxa de vácuo de silicone ao redor da barb do adaptador de lâmina antes de conectá-lo, pois isso ajuda a evitar vazamentos de ar no sistema. Encha o frasco de fixação com 100 mililitros de YPD, e encha o frasco de crescimento com 200 mililitros de YPD. Certifique-se de que a tubulação lateral verde atinja a mídia em cada frasco.Certifique-se de que todas as válvulas estão abertas. Conecte a armadilha da bolha a um vácuo e conecte a bomba ao tubo lateral verde rio abaixo da armadilha da bolha. Bombeie o fluido a uma vazão de 3,3 mililitros por minuto para encher completamente o lado verde.Em seguida, dispense e descarte aproximadamente um a dois mililitros da mídia, porque o primeiro par de mililitros geralmente contêm células mortas ou detritos aleatórios. Certifique-se de que o lado verde da tubulação está cheio de mídia e não tem bolhas a jusante da armadilha de bolhas antes de prosseguir. Encha o slide do canal e o reservatório com YPD, tomando cuidado para não introduzir bolhas.Conecte o slide ao aparelho de fluxo. Em seguida, bombeie mais fluido para criar um tampão de cerca de 5 metros no lado laranja. Isto é para evitar a captura acidental de ar no slide em caso de backflow.Agora, prepare o aparelho de fluxo para o transporte para o microscópio, primeiro plantando a entrada e a saída da armadilha de bolhas fechada. Em seguida, fixe as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja fechadas. Certifique-se de que as tampas do parafuso para o amortecedor de pulsação e a garrafa do filtro estão apertadas, pois elas podem se soltar durante a autoplacação.Desconecte a bomba da tubulação para facilitar o transporte. Em seguida, mova todos os componentes, incluindo o agitador de placa quente, para um recipiente secundário perto do microscópio. Conecte a sonda de temperatura ao agitador de placa quente e comece a aquecer o frasco de fixação a 37 graus Celsius.Mexa a mídia a 300 RPM, e mantenha isso durante todo o experimento. Monte o slide no microscópio e use a fita, se necessário, para fixá-lo firmemente. Em seguida, anexar a armadilha bolha a um vácuo.Agora, conecte a bomba ao aparelho de fluxo. Inicie a bomba a uma vazão de 3,3 mililitros por minuto e deixe-a funcionar por aproximadamente cinco a 10 segundos. Então, remova a armadilha da bolha no clã da tampa solta.Deixe a bomba continuar funcionando enquanto o frasco de fixação aquece. Uma vez que o frasco de fixação e a câmara de incubação estejam ambos a 37 graus Celsius, adicione cultura suficiente durante a noite das células fúngicas ao frasco de fixação para alcançar um milhão de células por mililitro. Aguarde 15 minutos para permitir que as células se aclimatem.Abra as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja enquanto fecha ambas as válvulas de frasco de crescimento para iniciar o fluxo das células. Aguarde aproximadamente cinco minutos para permitir que as células cheguem ao slide. Durante esse tempo, concentre o microscópio e ajuste-o aos mesmos parâmetros de imagem usados em experimentos anteriores.Inicie a aquisição de imagens para a fase de anexo. Volte depois de aproximadamente cinco e 10 minutos para garantir que o foco tenha sido mantido. Se não, tente ajustar o foco imediatamente após a próxima imagem ser adquirida.Imediatamente após o término da fase de anexo, salve o arquivo. Em seguida, abra as válvulas de frasco de crescimento do lado verde e laranja enquanto fecha ambas as válvulas de frasco de fixação. Tome cuidado para não bater o palco se houver válvulas dentro da câmara de incubação.Desligue a sonda do termômetro e substitua o frasco de fixação pelo frasco de crescimento. Agora, configure o software para adquirir uma imagem a cada 15 minutos ao longo de 22 horas, e iniciar a aquisição de imagens para a fase de crescimento. Uma vez concluída a fase de crescimento e o arquivo foi salvo, abra as válvulas de frasco de fixação lateral verde e laranja, o que pode fazer um ruído à medida que a pressão é liberada no lado laranja.Puxe para cima na tubulação lateral verde vindo de ambos os frascos de mídia, até que eles estão pelo menos vários centímetros acima da mídia. Em seguida, execute a bomba em alta velocidade para remover toda a mídia da tubulação, o que torna a limpeza muito mais fácil. Finalmente, quantifique os vídeos conforme descrito no protocolo de texto.Este vídeo de microscopia de campo escuro mostra a fixação de células albicanas do tipo selvagem Candida ao subfluxo do substrato durante a fase de apego, seguido pelo crescimento e desenvolvimento subsequentes durante a fase de crescimento que levou à formação de biofilme. Os dados desses vídeos podem ser analisados para as taxas de apego celular e descolamento e biomassa ao longo do tempo, mostrados aqui é a biomassa total dentro da região de imagem, conforme determinado pela análise de densitometria. A taxa cumulativa de apego celular e o desprendimento percentual de biomassa ao longo do tempo também são mostrados.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar as mesmas condições de imagem em todos os experimentos, pois isso permite que comparações quantitativas sejam feitas entre eles.

Research

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Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...