Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Los autores desean reconocer el Dr. Wade Sigurdson para proporcionar valiosas contribuciones en el diseño de los aparatos de flujo.

1. montar el aparato de flujo
<ol><li>Configurar las piezas listadas en la Tabla de materiales de acuerdo con el esquema en la figura 1 con las consideraciones que se discuten más abajo. Nota: Para mayor comodidad, el flujo de aparatos se dividieron en dos partes, la parte verde (todo aguas arriba de la corredera a los frascos de los medios de comunicación) y la naranja lado (todo aguas abajo de la diapositiva para los frascos de los medios de comunicación).<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Utilizando el sistema de flujo señalados anteriormente permite la generación de vídeos Time-lapse cuantitativas de biofilm hongos crecimiento y desarrollo. Para permitir comparaciones entre experimentos es de vital importancia para poder garantizar los parámetros de proyección de imagen son el mismo. Esto incluye asegurar que el microscopio está configurado para la iluminación Köhler para cada experimento (muchas guías están disponibles en línea para este proceso). Aparte de los parámetros de la proyección d...

Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico oportunista de seres humanos que pueden infectar a muchos tipos de tejido, incluyendo superficies de la mucosa orales, provocando candidiasis orofaríngea y resultando en una menor calidad de vida para los individuos afectados1. Formación de biofilms es una característica importante para la patogenia de la C. albicans, y se han realizado numerosos estudios sobre la formación y la función de C. albicans biofilms2,3,4, 5, muchos de los cuales se realizan en estática (sin flujo) en vitro modelos. Sin embargo, C. albicans debe adherirse y crecer en presencia de flujo salival en la cavidad bucal. Han desarrollado numerosos sistemas para permitir que células vivas imágenes6,7,8,9,10. Estos diferentes sistemas han sido diseñados para diferentes propósitos, y por lo tanto cada sistema tiene diferentes fortalezas y debilidades. Hemos encontrado que muchos del flujo de los sistemas apropiados para C. albicans eran costosos, complejo requiere fabricación de partes, o no podía ser había reflejada durante el flujo y tuvo que ser parado antes de la proyección de imagen. Por lo tanto, hemos desarrollado un aparato de flujo novela para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans bajo flujo11. Durante el diseño de nuestro aparato de flujo, seguimos estas consideraciones principales. En primer lugar, queríamos ser capaces de cuantificar varios aspectos del crecimiento del biofilm y desarrollo en tiempo real sin requerir el uso de células fluorescentes (permitiéndonos estudio cepas mutantes y aislados clínicos sin modificar fácilmente). En segundo lugar, queríamos que todas las partes a ser comercialmente disponibles con poca o ninguna modificación (es decir., no hay fabricación de encargo), permitiendo que otros más fácilmente recrean nuestro sistema y permitir fácil reparación. En tercer lugar, también hemos querido permitir extendido veces a velocidades de flujo razonablemente alta de imagen. Por último, hemos querido, después de un período de fijación para el sustrato bajo flujo, de células para controlar el crecimiento de biofilm en un período de tiempo sin la introducción de nuevas células.
Estas consideraciones nos llevaron a desarrollar el sistema de flujo recirculación dos frasco, ilustrado en la figura 1. Los dos matraces nos permiten dividir el experimento en dos fases, una fase de apego que extrae del frasco de semillas celular accesorio y una fase de crecimiento que utiliza los medios libres de células para continuar el crecimiento de biopelícula sin la adición de nuevas células. Este sistema está diseñado para trabajar con una cámara de incubación para el microscopio, con la corredera y el tubo anterior (de 2 a 5, figura 1) se coloca dentro de la incubadora, y todos los componentes colocan en un contenedor secundario grande fuera de la microscopio. Además, se utiliza un agitador de placa calefactora con un sensor de temperatura conectado para mantener células fúngicas en el matraz de accesorio a 37 ° C. Mientras está recirculando, este sistema es capaz de la proyección de imagen continua durante el flujo (puede ser más de 36 horas dependiendo de las condiciones) y puede utilizarse en la mayoría de los microscopios, incluyendo microscopios de mesa vertical o invertido. Aquí discutimos el montaje, operación, y la limpieza de los aparatos de flujo, así como proporcionar algunos algoritmos cuantitativos básicos de ImageJ para analizar los videos después de un experimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

En la candidiasis orofaríngea, miembros del género Candida deben cumplir y crecen en la superficie de la mucosa oral mientras que bajo los efectos del flujo salival. Mientras que se han desarrollado modelos para el crecimiento bajo flujo, muchos de estos sistemas son caros, o no permiten la proyección de imagen mientras que las células están bajo flujo. Hemos desarrollado un novedoso aparato que permite el crecimiento y desarrollo de las células de la Candida albicans bajo flujo y en tiempo real de la imagen. Aquí detallamos el protocolo para el montaje y el uso de este aparato de flujo, así como la cuantificación de los datos que se generan. Somos capaces de cuantificar los tipos de las células a y separan de la diapositiva, así como determinar una medida de la biomasa en la diapositiva con el tiempo. Este sistema es económico y versátil, trabajando con muchos tipos de microscopios ópticos, como microscopios de mesa barato, y es capaz de extendido veces en comparación con otros sistemas de flujo de imágenes. En general, se trata de un sistema de bajo rendimiento que puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre el crecimiento de biofilm de especies fúngicas bajo flujo.

Imágenes representativas de un normal noche Time-lapse experimento usando tipo C. albicans las células a 37 ° C se aprecia en la figura 2A y 1 de Video suplementaria. Las imágenes han sido contraste mejorado para mejorar la visibilidad. Se realizó la cuantificación de los datos originales, y gráficos representativos pueden verse en la figura 2B. Para generar estos...

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Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo el flujo de fluidos altera el crecimiento y desarrollo de biopelículas fúngicas. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite evaluar cuantitativamente los efectos del flujo sobre el crecimiento y desarrollo de biopelículas en tiempo real. Comience este experimento con el montaje del aparato de flujo, como se describe en el protocolo de texto.El día del experimento, adjunte la trampa de burbujas, la sonda de temperatura y todos los componentes de un solo uso. Para montar el filtro, retire el émbolo de una jeringa de un mililitro para convertirlo en un adaptador. Forzar el tubo de la botella de filtro en este extremo y fijar un filtro de 2 micras al tubo que conduce al matraz de crecimiento.Aplique grasa de vacío de silicona alrededor de la púa del adaptador de diapositivas antes de conectarlo, ya que esto ayuda a evitar fugas de aire en el sistema. Llene el matraz de fijación con 100 mililitros de YPD, y llene el matraz de crecimiento con 200 mililitros de YPD. Asegúrese de que el tubo lateral verde llegue al soporte de cada matraz.Asegúrese de que todas las válvulas estén abiertas. Coloque la trampa de burbujas en un vacío y conecte la bomba al tubo lateral verde aguas abajo de la trampa de burbujas. Bombee el fluido a un caudal de 3,3 mililitros por minuto para llenar completamente el lado verde.Luego, dispensar y desechar aproximadamente uno a dos mililitros de los medios, porque el primer par de mililitros a menudo contienen células muertas o desechos aleatorios. Asegúrese de que el lado verde de la tubería está lleno de medios y no tiene burbujas aguas abajo de la trampa de la burbuja antes de continuar. Llene el portaobjetos y el depósito con YPD, teniendo cuidado de no introducir burbujas.Conecte la corredera al aparato de flujo. A continuación, bombee más líquido para crear un tampón de unos 5 metros en el lado naranja. Esto es para evitar que accidentalmente atrapa el aire en la diapositiva en caso de contraflujo.Ahora, prepare el aparato de flujo para el transporte al microscopio plantando primero la entrada y salida de la trampa de burbujas cerrada. A continuación, sujete las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas cerradas. Asegúrese de que las tapas de los tornillos para el amortiguador de pulsación y la botella de filtro estén apretadas, ya que pueden aflojarse durante el autoplacado.Desconecte la bomba del tubo para facilitar el transporte. A continuación, mueva todos los componentes, incluido el agitador de placa caliente, en un recipiente secundario cerca del microscopio. Fije la sonda de temperatura al agitador de placa caliente y comience a calentar el matraz de fijación a 37 grados Celsius.Revuelva el medio a 300 RPM y mantenga esto durante todo el experimento. Monte la diapositiva en el microscopio y utilice cinta adhesiva si es necesario para fijarla firmemente. A continuación, conecte la trampa de burbujas a un vacío.Ahora, conecte la bomba al aparato de flujo. Encienda la bomba a un caudal de 3,3 mililitros por minuto y permita que funcione durante aproximadamente cinco a 10 segundos. Luego, quita la trampa de burbujas en el clan de la tapa de salida.Deje que la bomba siga funcionando mientras el matraz de fijación se calienta. Una vez que el matraz de unión y la cámara de incubación estén a 37 grados centígrados, agregue suficiente cultivo nocturno de las células fúngicas al matraz de unión para llegar a un millón de células por mililitro. Espere 15 minutos para permitir que las células se aclimaten.Abra las válvulas de matraz laterales verdes y naranjas mientras cierra ambas válvulas de matraz de crecimiento para iniciar el flujo de células. Espere aproximadamente cinco minutos para permitir que las células lleguen a la diapositiva. Durante este tiempo, enfoque el microscopio y ajuste a los mismos parámetros de imagen utilizados en experimentos anteriores.Comience la adquisición de imágenes para la fase de enlace. Vuelva después de aproximadamente cinco y 10 minutos para asegurarse de que se ha mantenido el enfoque. Si no es así, intente ajustar el enfoque inmediatamente después de adquirir la siguiente imagen.Inmediatamente después de que finalice la fase de datos adjuntos, guarde el archivo. A continuación, abra las válvulas de matraz de crecimiento lateral verde y naranja mientras cierra ambas válvulas de matraz de fijación. Tenga cuidado de no golpear la etapa si hay válvulas dentro de la cámara de incubación.Desconecte la sonda del termómetro y sustituya el matraz de fijación por el matraz de crecimiento. Ahora, configure el software para adquirir una imagen cada 15 minutos durante 22 horas, y comience la adquisición de imágenes para la fase de crecimiento. Una vez finalizada la adquisición de la fase de crecimiento y guardado el archivo, abra las válvulas de matraz de fijación lateral verde y naranja, lo que puede hacer un ruido a medida que la presión se libera en el lado naranja.Tire hacia arriba en el tubo lateral verde procedente de ambos matraces de medios, hasta que estén por lo menos varios centímetros por encima del medio. A continuación, ejecute la bomba a una alta velocidad para eliminar todos los medios de la tubería, lo que hace que la limpieza sea mucho más fácil. Por último, cuantifique los vídeos como se describe en el protocolo de texto.Este video de microscopía de campo oscuro time lapse muestra la unión de células albican de tipo salvaje Candida a la subfluencia del sustrato durante la fase de fijación, seguido por el crecimiento y desarrollo posterior durante la fase de crecimiento que conduce a la formación de biopelículas. Los datos de estos videos se pueden analizar para las tasas de unión celular y desprendimiento y biomasa a lo largo del tiempo, que se muestra aquí es la biomasa total dentro de la región de imágenes según lo determinado por el análisis de densitometría. También se muestra la tasa acumulada de unión celular y el porcentaje de desprendimiento de biomasa a lo largo del tiempo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar las mismas condiciones de imagen en todos los experimentos, ya que esto permite realizar comparaciones cuantitativas entre ellos.

Research

JoVE Journal

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Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...