Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Författarna vill erkänna Dr. Wade Sigurdson för att ge värdefull input i utformningen av flow apparaten.

1. Montera Flow apparaten
<ol><li>Konfigurera de delar som anges i Tabell av material enligt schematiskt Figur 1 med överväganden diskuteras nedan. Notera: För enkelhetens skull flödet apparater är uppdelad i två sidor, den gröna sidan (allt uppströms av bilden till media kolvar) och orange sida (allt nedströms av bilden till media kolvar).<ol>
<li>Se till att allt flöde apparaten är lufttäta som att förhindra läckor, med undantag av media kolvar (<strong ...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Använder systemets flöde kan enligt ovan för generering av kvantitativa time-lapse video av svamp biofilm tillväxt och utveckling. För att möjliggöra jämförelser mellan experiment är det av avgörande betydelse att säkerställa att parametrarna imaging hålls samma. Detta inkluderar att säkerställa att mikroskopet är inställd för Köhler belysning för varje experiment (många guider är tillgängliga online för denna process). Bortsett från imaging parametrar, finns det några viktiga steg att ha i åt...

Candida albicans (C. albicans) är en opportunistisk svamp patogen för människor som kan infektera många vävnadstyper, inklusive oral slemhinne ytor, orsakar orofaryngeal candidiasis och resulterar i en lägre livskvalitet för drabbade individer1. Biofilm bildning är ett viktigt kännetecken för patogenesen av C. albicans, och många studier har gjorts på bildandet och funktionen av C. albicans biofilmer2,3,4, 5, varav många har utförts med statisk (inget flöde) in vitro- modeller. C. albicans måste dock följa och växa i närvaro av saliv flöde i munhålan. Talrika flödessystem har utvecklats för att tillåta för live-cell imaging6,7,8,9,10. Dessa olika flödessystem har utformats för olika ändamål, och därför varje system har olika styrkor och svagheter. Vi fann att många av flödet system lämpliga för C. albicans var kostsamma, krävs komplex fabricerade delar, eller kan inte avbildas under flöde och måste att stoppas innan imaging. Därför utvecklade vi en roman flöde apparater för att studera C. albicans biofilm bildning under flöde11. Under utformningen av vår flöde apparater följde vi dessa stora överväganden. Först, vi ville kunna kvantifiera flera aspekter av biofilm tillväxt och utveckling i realtid utan att kräva användning av fluorescerande celler (tillåter oss att studien mutant stammar och omodifierad kliniska isolat enkelt). För det andra ville vi alla delar ska vara kommersiellt tillgänglig med lite att inga ändringar (dvs., ingen anpassad fabrication), tillåter andra att mer enkelt återskapa vårt system och möjliggör lätt reparationer. För det tredje, vi ville också möjliggör utökade imaging gånger vid någorlunda höga flöden. Slutligen, vi ville, efter en period av celler fästa på substratet under flöde, för att kunna övervaka den biofilm tillväxten över en längre tid utan att införa nya celler.
Dessa överväganden ledde oss till att utveckla den två-kolv recirkulerande flödessystem illustreras i figur 1. Två kolvar tillåter oss att dela experimentet till två faser, en bifogad fil fas som drar från cell-seedade fastsättning kolven och en tillväxtfas som använder cell-fria medier för att fortsätta biofilm tillväxten utan tillsats av nya celler. Systemet är utformat för att arbeta med en inkubation kammare för mikroskopet, med bilden och slangen före det (2 – 5, figur 1) placeras inuti inkubatorn, och alla andra komponenter placeras i en stor sekundär behållare utanför den Mikroskop. Dessutom används en kokplatta omrörare med en bifogad temperatursond för att upprätthålla svampceller i bifogad fil kolven vid 37 ° C. Som det är recirkulerande, detta system klarar av kontinuerlig avbildning under flöde (kan vara över 36 h beroende på villkor), och kan användas på de flesta vanliga Mikroskop, inbegripet upprätt eller omvänt bänkmonterade Mikroskop. Här diskuterar vi montering, drift och rengöring av flow apparaten, samt som ger några grundläggande ImageJ kvantitativa algoritmer att analysera videor efter ett experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

I orofaryngeal candidiasis, måste medlemmar av släktet Candida följa och växa på muntliga slemhinneepitel medan under påverkan av saliv flöde. Och modeller för tillväxt under flöde har utvecklats, många av dessa system är dyra, eller Tillåt inte imaging medan cellerna är under flöde. Vi har utvecklat en ny apparat som tillåter oss att bild tillväxt och utveckling av Candida albicans celler under flöde och i realtid. Här, detalj vi protokollet för montering och användning av denna apparat i flöde, samt kvantifiering av data som genereras. Vi kan kvantifiera de priser som cellerna fäst och lossa från bilden, samt att fastställa ett mått av biomassa i bilden över tid. Detta system är både ekonomiskt och mångsidigt, arbetar med många typer av ljus Mikroskop, inbegripet billig bänkmonterade Mikroskop, och kan utökas imaging gånger jämfört med andra flödessystem. Sammantaget är detta en låg genomströmning-system som kan ge mycket detaljerade realtid information om biofilm tillväxten av svamp arter under flöde.

Representativa bilder av en normal övernattning time-lapse experiment med vildtyp C. albicans celler vid 37 ° C kan ses i figur 2A och kompletterande Video 1. Bilderna har varit kontrast för att förbättra sikten. Kvantifiering av de ursprungliga uppgifterna utfördes, och representativa grafer kan ses i figur 2B. För att generera dessa grafer, data var först norma...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Vi beskriver montering, drift, och rengöring av ett flöde apparater för bild-svamp biofilm bildning i realtid medan under flöde. Vi tillhandahåller också och diskutera kvantitativa algoritmer som ska användas på de förvärvade bilderna.

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom mikrobiologi området, till exempel hur vätskeflödet förändrar svamp biofilm tillväxt och utveckling. Den största fördelen med denna teknik är det tillåter oss att kvantitativt utvärdera effekterna av flöde på biofilm tillväxt och utveckling i realtid. Påbörja detta experiment med montering av flödesapparaten, som beskrivs i textprotokollet.Dagen för experimentet, fäst bubbelfällan, temperatursonden och alla komponenter för engångsbruk. För att sätta ihop filtret, ta bort kolven från en en milliliterspruta för att göra den till en adapter. Tvinga slangen från filterflaskan in i denna ände och fäst ett 2 mikronfilter på slangen som leder till tillväxtkolven.Applicera silikonvakuumfett runt hullingen av glidadaptern innan den ansluts, eftersom detta hjälper till att förhindra att luft läcker in i systemet. Fyll fastsättningskolven med 100 milliliter YPD, och fyll på tillväxtkolven med 200 milliliter YPD. Se till att den gröna sidan slangar når media i varje kolv.Se till att alla ventiler är öppna. Fäst bubbelfällan på ett vakuum, och anslut pumpen till den gröna sidan slangar nedströms bubblan fällan. Pumpa vätskan med en flödeshastighet på 3,3 milliliter per minut för att helt fylla den gröna sidan.Sedan, dispensera och kassera ungefär en till två milliliter av media, eftersom de första par milliliter ofta innehåller döda celler eller slumpmässigt skräp. Se till att den gröna sidan av slangen är fylld med media och har inga bubblor nedströms av bubbelfällan innan du fortsätter. Fyll kanalbilden och reservoaren med YPD, var noga med att inte införa bubblor.Anslut glidningen till flödesapparaten. Pumpa sedan mer vätska för att skapa en buffert på ca 5 meter på den orange sidan. Detta för att förhindra att oavsiktligt svälla luft i bilden i händelse av bakflöde.Nu, förbereda flödesapparaten för transport till mikroskopet genom att först plantera inloppet och utlopp av bubblan fällan stängd. Kläm sedan fast de gröna och orange sida fastsättningskolvventilerna stängda. Säkerställ att skruvlocken för pulsationsdämparen och filterflaskan sitter tätt, eftersom de kan lossa vid autoplating.Koppla bort pumpen från slangen för att underlätta transporten. Flytta sedan alla komponenter, inklusive värmeplatta omröraren, i en sekundär behållare nära mikroskopet. Fäst temperatursonden på värmeplatta omröraren, och börja värma infästningskolven till 37 grader Celsius.Rör om i media vid 300 RPM, och underhåll detta för hela experimentet. Montera bilden på mikroskopet, och använd tejp om det behövs för att tätt säkra den. Fäst sedan bubbelfällan på ett vakuum.Nu, anslut pumpen till flödesapparaten. Starta pumpen med en flödeshastighet på 3,3 milliliter per minut, och låt den gå i ungefär fem till tio sekunder. Sedan, ta bort bubblan fällan i let-out lock klan.Låt pumpen fortsätta köras medan tillsatskolven värms upp. När fästkolven och inkubationskammaren båda ligger på 37 grader Celsius, tillsätt tillräckligt med lättvarvnadskultur av svampcellerna till fästkolven för att nå en miljon celler per milliliter. Vänta i 15 minuter så att cellerna kan acklimatisera sig.Öppna både gröna och orange sida infästning kolv ventiler samtidigt stänga båda tillväxt kolv ventiler för att starta flödet av celler. Vänta i ungefär fem minuter så att celler kan nå bilden. Under denna tid, fokusera mikroskopet och justera den till samma bildframställning parametrar som används i tidigare experiment.Påbörja bildförvärv för kvarstadsfasen. Kom tillbaka efter cirka fem och 10 minuter för att säkerställa att fokus har bibehållits. Om inte, försök att justera fokus omedelbart efter nästa bild har förvärvats.Omedelbart efter att bilagefasen är klar sparar du filen. Öppna sedan både gröna och orange sida tillväxt kolv ventiler medan du stänger båda infästning kolv ventiler. Var noga med att inte stöta på scenen om några ventiler finns inne i inkubationskammaren.Dra ur termometersonden, och sätt tillbaka fästkolven med tillväxtkolven. Nu, konfigurera programvaran för att skaffa en bild var 15 minuter över 22 timmar, och börja bild förvärv för tillväxtfasen. När förvärv av tillväxtfasen har avslutats och filen har sparats, öppna de gröna och orangea sidotillbehörskolvventilerna, som kan göra ett ljud när trycket släpper på den orangea sidan.Dra upp på den gröna sidan slangar som kommer från båda media kolvar, tills de är minst flera centimeter ovanför media. Kör sedan pumpen i hög hastighet för att ta bort alla medier från slangarna, vilket gör rengöringen mycket enklare. Slutligen kvantifiera videorna som beskrivs i textprotokollet.Denna tid förfaller mörkt fält mikroskopi video visar fastsättning av vilda typ Candida albican celler till substrat underflödet under fästfasen, följt av den efterföljande tillväxt och utveckling under tillväxtfasen leder till biofilm bildas. Data från dessa videor kan analyseras för andelen cell fastsättning och lossnar och biomassa över tiden, som visas här är den totala biomassa inom bildframställning regionen som bestäms av densitometry analys. Den kumulativa andelen celltillbehör och procentens avlossning av biomassa över tiden visas också.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att använda samma bildframställning villkor i alla experiment, eftersom detta möjliggör kvantitativa jämförelser som ska göras mellan dem.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Realtid avbildning av Leukotriene B 4 Medierad Cell Migration och BLT1 Interaktioner med β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Utveckling av en negativ markör för Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kvantifiering av Svamp kolonisering, sporogenes och produktion av mykotoxiner användningen av kernel Bioanalyser

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Teknik för Real-time, samtidig avbildning av TCR och dess associerade signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...