Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Yazarlar Dr. Wade Sigurdson değerli giriş akışı aparat tasarımı sağlamak için kabul etmek istiyorum.

1. montaj akışı aparatı
<ol><li>Şekil 1 ' deki şematik Malzemeler tablo aşağıda ele dikkat edilecek noktalar ile listelenen bölümleri yapılandırın. Not: kolaylık sağlamak için cihazı bölünmüş iki taraf, yeşil tarafı (medya şişeler için slaydın her akıntıya karşı) ve turuncu akışı yan (her şeyi aşağı slayt medya şişeler için).<ol>
<li>Tüm akışı aparatı hava medya şişeler (Şekil 1, 1) tek isti...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Akış sistemi kullanarak yukarıda belirtildiği gibi nicel hızlandırılmış videoları mantar biyofilm büyüme ve gelişme üretimi için izin verir. Deneyler arasında karşılaştırmalar için izin vermek için görüntüleme parametreleri aynı kalmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu mikroskop için Köhler aydınlatma (birçok kılavuzları online Bu işlem için kullanılabilir) her deneme için ayarlanır sağlanması içerir. Parametreleri görüntüleme bir yana, akış aparatı ile çalış...

Candida albicans (C. albicans) bir fırsatçı mantar patojen oral mukozal yüzeyler de dahil olmak üzere, oropharyngeal kandidiyazis neden ve daha düşük bir yaşam kalitesi için etkilenen bireylerin1sonuçlanan birçok doku türler, enfekte olabilir insanlar var. Biyofilm oluşumu için C. albicanspatogenezinde önemli bir özelliğidir ve oluşumu ve işlev C. albicans biyofilmler2,3,4çok sayıda çalışma yapılmıştır, 5birçoğu gerçekleştirdik statik (akımı) vitro kullanarak, modelleri. Ancak, C. albicans uygun ve ağız boşluğu tükürük akışında huzurunda büyümek gerekir. Çok sayıda akış sistemleri canlı hücre görüntüleme6,7,8,9,10için izin vermek için geliştirilmiştir. Bu farklı akış sistemleri farklı amaçlar için tasarlanmıştır ve bu nedenle her sistem farklı güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bulduk çok akış sistemleri C. albicans için uygun maliyetli, gerekli karmaşık parçaları, fabrikasyon veya değil olabilir akışı sırasında yansıma ve görüntüleme önce durdurulması gerekiyordu. Bu nedenle, C. albicans biyofilm oluşumu akışı11altında çalışmaya bir roman akışı aparatı geliştirdik. Akış cihazlarımızı tasarım sırasında bu önemli konuları takip ettik. İlk olarak, biyofilm büyüme ve gelişme içinde birden çok yönlerini ölçmek mümkün istedim floresan hücreleri (bize çalışma mutant suşları ve değiştirilmemiş klinik yalıtır kolayca izin) kullanımı gerektiren olmadan gerçek zamanlı. İkinci olarak, biz hiçbir değişiklik için çok az ile ticari olarak kullanılabilir olması için tüm parçaları istedim (i.e., hiçbir özel imalat), diğerleri daha kolayca sistemimiz yeniden sağlayan ve kolay onarımlar için izin. Üçüncü olarak, aynı zamanda genişletilmiş için izin istedim zaman makul yüksek akış oranları görüntüleme. Son olarak, döneminden sonra hücre yüzey akışı altında için ekleme bir genişletilmiş bir zaman içinde biyofilm büyüme yeni hücre tanıtımı olmadan izlemek edebilmek için istedik.
Bunu göz önünde iki şişeye dolaşım akış sistemi Şekil 1' de gösterildiği geliştirmek için bize yol. İki şişe deney iki aşama, hücre numaralı seribaşı eki balonun çizer bir eki faz ve biyofilm büyüme yeni hücreler ek olmadan devam etmek için medya boş hücre kullanır bir büyüme aşamasında içine bölmek sağlamak. Bu sistem (2-5 Şekil 1) inkübatör içinde konuyor kendisinden önce boru ve slayt ile mikroskop için bir kuluçka odası ile çalışacak şekilde tasarlanmıştır ve tüm diğer bileşenleri yerleştirilen dışında büyük bir ikincil kap içinde mikroskop. Ayrıca, bir Pinar karıştırıcı bir ekli sıcaklık probu ile 37 ° C'de eki şişeyi mantar hücreleri korumak için kullanılır Sirkülasyon gibi bu sistem (36 h üzerinden koşullara bağlı olarak olabilir) akışı sırasında sürekli görüntüleme yeteneğine sahiptir ve dik veya ters benchtop mikroskoplar dahil olmak üzere çoğu standart mikroskoplar kullanılabilir. Burada, biz derleme işlemi, ele ve akış aparatı temizlik, de gibi videoları bir deneyden sonra analiz etmek için bazı temel ImageJ nicel algoritmalar sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

Oropharyngeal kandidiyazis içinde Candida cinsinin üyeleri uygun ve süre tükürük akışı etkileri altında oral mukozal yüzeyinde büyümek gerekir. Akış altında büyüme modellerinde geliştirilmiş olsa da, bu sistemlerin pek çok pahalı veya hücreleri akış altında iken görüntüleme izin vermiyor. Büyüme ve gelişme Candida albicans hücre akışı altında ve gerçek zamanlı görüntü için bize izin verir yeni bir cihaz geliştirdik. Burada, derleme ve bu akışı cihaz kullanımı yanı sıra oluşturulan veri miktar için protokolü ayrıntılı. Biz bu hücreleri ekleyin ve slayttan slayt üzerinde biyokütle ölçüsü zaman içinde belirlemek için, de ayırmak oranları ölçmek edebiliyoruz. Ve bu sistem hem ekonomik hem çok yönlü, ışık mikroskoplar, ucuz benchtop mikroskoplar, dahil olmak üzere birçok türleri ile çalışma yeteneğine sahip olan diğer akış sistemlerine göre kez Imaging genişletilir. Genel olarak, bu son derece ayrıntılı gerçek zamanlı bilgi akışı altında mantar türlerinin biyofilm büyüme sağlayabilen bir düşük işlem hacmi sistemdir.

Temsili resim normal bir gecede hızlandırılmış deney vahşi-türü C. albicans kullanarak hücreleri 37 ° C'de Şekil 2A ve Tamamlayıcı Video 1' de görülebilir. Görüntüleri görünürlüğünü artırmak için gelişmiş kontrast olmuştur. Miktar özgün verilerin gerçekleştirilmiş ve temsilcisi grafikler Şekil 2' deBgörülebilir. Bu grafikler oluştur...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Bu yöntem, mikrobiyoloji alanındaki sıvı akışının mantar biyofilm büyümesini ve gelişimini nasıl değiştirdiği gibi anahtar soruların yanıtlatmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akışın biyofilm büyümesi ve gelişimi üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak nicel olarak değerlendirmemize olanak sağlamasıdır. Bu denemeyi, metin protokolünde açıklandığı gibi akış aygıtının montajıyla başlatın.Deney günü, kabarcık tuzağı, sıcaklık sondası ve tüm tek kullanımlık bileşenleri takın. Filtreyi monte etmek için, bir mililitrelik şırıngadan pistonu çıkararak adaptör yapın. Bu uç içine filtre şişesinden boru kuvvet ve büyüme şişesi ne kadar boru 2 mikron filtre takın.Bu sisteme hava sızıntılarını önlemeye yardımcı olur gibi, bağlanmadan önce slayt adaptörün barb etrafında silikon vakum gres uygulayın. Ek şişesini 100 mililitre YPD ile doldurun ve büyüme şişesini 200 mililitre YPD ile doldurun. Yeşil yan borunun her şişede ortama ulaştığından emin olun.Tüm vanaların açık olduğundan emin olun. Bir vakum kabarcık tuzak takın ve kabarcık tuzak aşağı yeşil yan boru pompa bağlayın. Tamamen yeşil tarafı doldurmak için dakikada 3,3 mililitre lik bir akış hızında sıvı pompası.Daha sonra, yaklaşık bir ila iki mililitre medya dağıtın ve atın, çünkü mililitreilk çift genellikle ölü hücreler veya rasgele enkaz içerir. Borunun yeşil tarafının medya yla dolu olduğundan ve devam etmeden önce kabarcık kapanının aşağısında kabarcıklar olmadığından emin olun. Kanal slaytını ve rezervuarı YPD ile doldurun, kabarcıkları tanıtmamaya özen gösteriyor.Slaydın akış aygıtına bağlayın. Sonra turuncu tarafında yaklaşık 5 metre lik bir tampon oluşturmak için daha fazla sıvı pompası. Bu, geri akış durumunda yanlışlıkla slaytta hava yakalamaönlemek içindir.Şimdi, ilk kabarcık kapanı giriş ve çıkış kapalı dikim tarafından mikroskop aparatı taşıma için hazırlayın. Sonra yeşil ve turuncu yan eki şişe vanaları kapalı kenetleyin. Nabız sönümleyici ve filtre şişesi için vida kapaklarının sıkı olduğundan emin olun, çünkü otokaplama sırasında gevşeyebilirler.Taşımayı kolaylaştırmak için pompayı borudan çıkarın. Daha sonra sıcak tabak karıştırıcı da dahil olmak üzere tüm bileşenleri mikroskopa yakın ikincil bir kap içine taşıyın. Sıcaklık probusıcak karıştırıcı ya takın ve ek şişesini 37 dereceye Kadar ısıtmaya başlayın.Ortamı 300 RPM'de karıştırın ve tüm deneme boyunca bunu koruyun. Slızı mikroskopa monte edin ve gerekirse sıkıntıya sıkıntıyı sıkıntıya güçl Sonra bir vakum kabarcık tuzak takın.Şimdi, pompayı akış cihazına bağlayın. Pompayı dakikada 3,3 mililitre lik bir akış hızıyla çalıştırın ve yaklaşık 5 ila 10 saniye boyunca çalışmasını bekleyin. Sonra, let-out kapak klan kabarcık tuzak kaldırın.Ek şişesi ısınırken pompanın çalışmaya devam etmesine izin verin. Bir kez ek şişe ve kuluçka odası hem de 37 santigrat derece, ek şişe mililitre başına bir milyon hücreulaşmak için yeterli gecede kültür ekleyin. Hücrelerin alışması için 15 dakika bekleyin.Hücrelerin akışını başlatmak için her iki büyüme flask vanaları kapatırken hem yeşil hem de turuncu yan eki flask vanaları açın. Hücrelerin slayta ulaşmasını sağlamak için yaklaşık beş dakika bekleyin. Bu süre zarfında, mikroskobu odakla ve önceki deneylerde kullanılan aynı görüntüleme parametrelerine göre ayarlayın.Ek aşaması için görüntü edinimi başlatın. Odak noktasının korundığından emin olmak için yaklaşık beş ve 10 dakika sonra tekrar kontrol edin. Değilse, bir sonraki görüntü alındıktan hemen sonra odağı ayarlamaya çalış.Ek aşaması tamamlandıktan hemen sonra dosyayı kaydedin. Daha sonra her iki ek şişe vanaları kapatırken hem yeşil hem de turuncu yan büyüme flask vanaları açın. Kuluçka odasının içinde herhangi bir vana varsa, sahneyi çarpmamaya dikkat edin.Termometre probunun fişini çekin ve ek şişeyi büyüme şişesiile değiştirin. Şimdi, yazılımı 22 saat içinde her 15 dakikada bir görüntü elde etmek için yapılandırın ve büyüme aşaması için görüntü edinimi başlar. Büyüme aşaması edinimi tamamlandıktan ve dosya kaydedildikten sonra, turuncu tarafta basınç serbest olarak bir gürültü yapabilir yeşil ve turuncu yan eki maadavan, açın.Her iki medya şişesinden gelen yeşil yan boruları, medyanın en az birkaç santimetre yukarısından çıkana kadar yukarı çekin. Daha sonra, çok daha kolay temizlik yapar boru, tüm medya kaldırmak için yüksek bir hızda pompa çalıştırın. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi videoları ölçün.Bu zaman atlamalı karanlık alan mikroskobu video ek aşamasında alt tabaka altında vahşi tip Candida albican hücrelerinin eki gösterir, biyofilm oluşumuna yol açan büyüme aşamasında sonraki büyüme ve gelişme izledi. Bu videolardan elde edilen veriler zaman içinde hücre eki ve kopma ve biyokütle oranları için analiz edilebilir, burada gösterilen densitometri analizi ile belirlenen görüntüleme bölgesi içinde toplam biyokütle. Hücre ekinin kümülatif oranı ve zaman içinde yüzde biyokütle kopması da gösterilir.Bu yordamı denerken, tüm denemelerde aynı görüntüleme koşullarını kullanmayı unutmamak önemlidir, çünkü bu, aralarında nicel karşılaştırmalar yapılmasına olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Negatif Seçilebilir Marker Geliştirme Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...