Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

وأيد هذا العمل جامعة كولورادو مدرسة الطب عميد جائزة "الهياكل الأساسية للبحوث الاستراتيجية"، R01 HL086680-09 و 1R35HL139726-01، على جائزة الزمالة E.N.G. وكفريت كلية جامعة دبلن (أنه). يشكر المؤلفون الدكتورة ساندرا إيتون والدكتور جيرالد روزين الدكتور غاريث إيتون (جامعة دنفر)، والدكتور جوزيف ب. كاو (جامعة ميريلاند)، والدكتور المفارق إهداء (جامعة كولورادو دنفر) لإجراء مناقشات مفيدة وجوان مالتزاهن، أشلي ترومبي واللبلاب ماكدرموت (جامعة كولورادو دنفر) لتقديم الدعم التقني.

ووافقت جامعة كولورادو دنفر رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.
1-إعداد الكواشف
<ol><li>
الأسهم حمض (دتبا) ديثيلينيتريامينبينتاسيتيك (150 مم)
	<ol>
<li>إضافة ز 2.95 من دتبا (393.35 g/mol) إلى 10 مل مياه.</li>
		<li>لحل دتبا وإضافة 1 م هيدروكسيد الصوديوم دروبويسي...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

تقييم الإنتاج الحرة الراديكالية في إعدادات البيولوجية مهم في فهم الأكسدة ينظم الإشارات في الصحة والمرض، ولكن هذه الأنواع صعبة نظراً لأن نصف العمر القصير للأنواع الحرة الراديكالية والتقنية العالية قيود مع الأساليب استخداماً. الجيش الثوري الشعبي أداة قيمة وقوية في مجال البيولوجيا الأكسد...

بينما تكتسي تدابير للأنواع الأكسجين التفاعلية والأكسدة هامة لدراسة الأمراض المتنوعة عبر جميع نظم الجهاز، الكشف عن الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يمثل تحديا سبب نصف العمر القصير وتفاعلية عالية. أسلوب رنين باراماجنيتيك (EPR) إلكترون هو الأسلوب الأكثر لا لبس فيها للكشف عن الجذور الحرة. تحقيقات تدور لها مزايا أكثر من المسابر الفلورسنت الأكثر استخداماً. على الرغم من المسابر الفلورية غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام وتوفير الكشف السريع وحساسة من روس، لديهم قيود خطيرة بسبب إشارات artifactual، وعدم قدرة على حساب تركيزات روس، ونقص عام في خصوصية1 .
لتسهيل استخدام الجيش الشعبي الثوري للدراسات البيولوجية، دول متنوعة تدور قد تم توليفها المسابير التي يمكن قياس مجموعة من الأنواع ذات الصلة بيولوجيا الجزئيات الحرة، فضلا عن بو2ودرجة الحموضة والأكسدة والاختزال32،، 45،،،من67. كما تم وضع الفخاخ تدور لالتقاط الجذور لم تدم طويلاً و adducts النموذج الطويل غلاء المعيشة، مما يسهل الكشف عن الجيش الشعبي الثوري8. يكون كل من الفئات (تحقيقات تدور وتدور الفخاخ) مزايا وقيود. فئة استخداماً من المسابر تدور بدوري هيدروكسيلامينيس، وهي الجيش الشعبي الثوري-صامت وتتفاعل مع الجذور لم تدم طويلاً لتشكيل نيتروكسيدي مستقرة. هيدروكسيلامينيس دوري تتفاعل مع فائق أكسيد 100 مرة أسرع من الفخاخ تدور، وتمكينهم من التنافس مع المواد المضادة للأكسدة الخلوية، لكنها تفتقر إلى الدقة وتتطلب استخدام عناصر التحكم المناسبة ومثبطات التعرف على الأنواع المتطرفة أو مصدر مسؤولة عن إشارة نيتروكسيدي. بينما تدور الفخاخ خصوصية المعرض، مع مميزة الطيفية أنماط تبعاً للأنواع المحاصرين، لديهم حركية بطيئة لأكسيد فائق تدور محاصرة ومعرضة للتحلل الأحيائي الراديكالي adducts. وكانت طلبات تعويض تدور موثقة توثيقاً جيدا في البحوث الطبية الحيوية9،10،11،،من1213.
والهدف من هذا المشروع إظهار أساليب الجيش الشعبي الثوري العملي لتصميم التجارب وإعداد العينات للكشف عن فائق أكسيد استخدام تدور تحقيقات في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر وفي أنسجة مختلفة المقصورات في فيفو. وقد نشر المخطوطات عدة البروتوكولات ذات الصلة لهذه الأهداف، باستخدام المسابر نفاذية الخلية والخلية كتيمة المتقدرية تدور المستهدفة للنسيج في المختبر وعملية مختلفة من المقصورات الخلوية المستهدف للتحليل في نماذج الماوس 14 , 15-نحن نبني على هذه الهيئة للأدب بالتحقق من نهج لقياس أكسيد فائق باستخدام مجس تدور (غروهارلم) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر للتأكد من دقة القياسات، وتسليط الضوء على المشاكل التقنية المحتملة التي قد تحرف النتائج. نحن نقدم أيضا أساليب لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم والسوائل الغسل للفيسيولوجيا وأنسجة الرئة باستخدام مسبار تدور غروهارلم. هذه الدراسات المقارنة بين أساليب مختلفة لمعالجة الأنسجة، فضلا عن تقديم أسلوب آخر تدور المسبار، CPH، بحقن الفئران قبل الحصاد الأنسجة. وأخيراً، يمكننا وضع طريقة عملية لتخزين العينات في أنابيب تترافلوروايثيلين (PTFE) للسماح بتخزين ونقل العينات قبل القياسات الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

كشف دقيقة ومحددة للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الأقسام المختلفة من الخلايا والأنسجة وضروري لدراسة تنظم الأكسدة والاختزال إشارة في إعدادات البيولوجية. مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) هو الأسلوب المباشر الوحيد لتقييم الجذور الحرة لا لبس فيه. ميزته هي أن يكشف المستويات الفسيولوجية للأنواع المحددة مع خصوصية عالية، ولكنه يتطلب التكنولوجيا المتخصصة وإعداد نموذج دقيق وضوابط ملائمة لضمان التفسير الدقيق للبيانات. هيدروكسيلاميني دوري تدور تحقيقات تتفاعل بشكل انتقائي مع فائق أكسيد أو الجذور الأخرى لتوليد إشارة نيتروكسيدي التي يمكن قياسها كمياً بالتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري. المسابر نفاذية الخلية تدور وتدور المسابر المصممة لتتراكم سريعاً في الميتوكوندريا تسمح لتحديد تركيز أكسيد فائق في الأقسام الخلوية المختلفة.
في الخلايا المستزرعة، واستخدام 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine نفاذية الخلية (غروهارلم) جنبا إلى جنب مع ودون الخلية كتيمة فائق أكسيد الفاءق (الأحمق) المعالجة المسبقة، أو استخدام الخلية نفاذية شماعة-الهيئة العامة للسدود، يسمح التفريق بين من خارج الخلية من فائق أكسيد سيتوسوليك. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido المتقدرية] كلوريد بيبيريدينيوم (ميتو-الإيقاع-ح) تسمح بقياس روس المتقدرية (الغالب فائق أكسيد).
يمكن أيضا تطبيق المسابير تدور والتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري في فيفو النماذج. يمكن الكشف عن أكسيد فائق في السوائل خارج الخلية مثل الدم والسوائل السنخية، فضلا عن الأنسجة مثل أنسجة الرئة. يتم عرض عدة أساليب لمعالجة وتخزين الأنسجة للقياسات الجيش الشعبي الثوري وتقديم زيادة ونقصان (CPH) 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine عن طريق الحقن الوريدي مسبار فيفو. بينما يمكن إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة، العينات التي تم الحصول عليها من نماذج في المختبر و في فيفو يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية وتحليلها من قبل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك. يمكن تخزين مستقرة أنابيب المتخصصة في-80 درجة مئوية وتشغيل ك 77 لتمكين عملية، تتسم بكفاءة، واستنساخه بطريقة تسهل تخزين ونقل عينات العينات.

تم التحقق من صحة الكشف عن فائق أكسيد استخدام غروهارلم استخدام X/إكس فائق أكسيد توليد نظام لإثبات أن كان تماما تحول دون إشارة نيتروكسيدي (سم.) من الهيئة العامة للسدود، بينما حدث ليس له أي أثر (الشكل 1A). ثم تم تقييم دِيسمُوتاز المجموع، خارج الخلية في الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) أسلوب لا لبس فيها لقياس الجذور الحرة. يسمح استخدام المسابير تدور الانتقائي للكشف عن الجذور الحرة في الأقسام الخلوية المختلفة. نحن نقدم طريقة عملية وفعالة لجمع العينات البيولوجية التي تسهل معالجة وتخزين ونقل عينات للقياسات الجيش الشعبي الثوري.

استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

خلل التنظيم redox إشارات متورطة في التسبب في الأمراض المتنوعة. تتطلب دراسة بيولوجيا الأكسدة الحمراء الكشف الدقيق لأنواع الأكسجين التفاعلية في مختلف المقصورات الخلوية والأنسجة. التحليل الطيفي EPR هو الطريقة الوحيدة التي تقيس الجذور الحرة بشكل لا لبس فيه.ويبين هذا البروتوكول طريقة عملية لمعالجة وتخزين العينات البيولوجية من أجل التحليل الطيفي لـ EPR. وتوضح هذه البروتوكولات استخدام مسباري EPR و spin في نموذجين تمثيليين. على الرغم من أنها يمكن تكييفها لتقييم الأنواع النشطة في بيئات بيولوجية أخرى.تصميم التجربة والتعامل مع العينة أمران حاسمان لقابليتها في التكاثر. نوصي بالنظر في كثافة الخلايا وضمان ضوابط مناسبة مطابقة للوقت. تبدأ برفق غسل الخام 264.7 الخلايا مع ملليلتر واحد من كريبس Henseleit العازلة أو KHB، في بئر.وعلاج الخلايا مع 500 ميكرولتر من KHB، تستكمل مع 100 ميكروميل من DTPA في بئر. للمعالجة المسبقة مع dismutase أكسيد فائق، إضافة 15 ميكرولترات من مخزون dismutase فائقة أكسيد، أو مركبة، إلى كل بئر، ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية المعالجة المسبقة للـ superoxide dismutase، إضافة 12.5 ميكرولترات من 10 ملليمتر CMH و 40 ميكرولترات من 125 مجهرية PMA حل العمل إلى الآبار المناسبة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.ضع اللوحات على الجليد على الفور وجمع المخزن المؤقت من كل بئر إلى أنابيب 1.5 ملليلتر فردية على الجليد. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من KHB الطازجة بالإضافة إلى DTPA إلى كل بئر وكشط الخلايا بلطف من أسفل كل بئر. ثم إعادة تعليق الخلية مع الأنابيب ونقل الخلايا إلى أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية على الجليد.للكشف عن أكسيد فائق في درجة حرارة الغرفة، أولا تحميل 50 ميكرولترات من عينة واحدة العازلة أو خلية في أنبوب شعري وختم الأنبوب. ضع الأنبوب على الفور في الرنين البارامغناطيسي للإلكترون، أو EPR، مطياف وقم بتعيين معلمات الاستحواذ على EPR لقياسات درجة حرارة الغرفة. اختبار دائماً عينة فارغة من المخزن المؤقت تحتوي على نفس تركيز مسبار تعامل في ظل نفس الظروف التجريبية كتحكم.للكشف عن أكسيد فائق في 77 درجة كلفن، تحميل 150 ميكرولترات من عينة واحدة في قطعة بوصة واحد إلى اثنين من اثيلين البوليتيترافلورو على التوالي، أو PTFE، أنابيب، مع سدادة مطاطية في نهاية واحدة. ختم الطرف الآخر من الأنبوب مع سدادة ثانية وفلاش تجميد العينة في النيتروجين السائل. ثم قم بإزالة سدادات بسرعة ووضع أنابيب PTFE في أنبوب التبريد المسمى لتخزين النيتروجين السائل.بالنسبة إلى قياسات EPR، املأ الاصبع الهفوة من مطياف EPR بالنيتروجين السائل ووضع أنابيب PTFE التي تحتوي على العينة في النيتروجين السائل. ضع الاصبع في مطياف EPR وقم بتعيين معلمات الاستحواذ على EPR للقياسات عند 77 درجة كلفن. للكشف عن ROS في أنسجة الرئة المجمدة، ضع الأنسجة على الجليد الجاف واستخدم الملاقط لتثبيت الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف.قطع العينة إلى خمس قطع مليغرام 15، وتزن القطع في أنبوب 1.5 ملليلتر tared. إضافة 196 ميكرولترات من KHB بالإضافة إلى DTPA وأربعة microliters من CMH إلى العينة، واحتضان عينة الرئة لمدة ساعة واحدة في حمام الماء 37 درجة مئوية قبل تعبئة شظايا الأنسجة مع الطرد المركزي وجيزة. ثم ضع العينة على الجليد قبل نقل 150 ميكرولترات من المابير إلى قطعة من أنابيب PTFE لتجميد فلاش استعدادا لقياس EPR كما أظهرت للتو.تقييم إجمالي إنتاج أكسيد فائق في الخام 264.7 الخلايا حفزت مع PMA كما هو موضح، ويكشف أن تركيز النيتريكسيد في كل من تعليق الخلية والعزلة من الخلايا المعالجة PMA مماثلة، وذلك بسبب الطبيعة نفاذية وسرعة التوازن في التحقيق تدور. وذريكا النيتريكسيد الزيادات في إشارة الخلايا الخام 264.7 حفزت مع PMA، بالمقارنة مع الخلايا التحكم، ولكن ليس في الخلايا قبل المعالجة مع الخلايا منيعة سوبر أكسيد dismutase. كما أن تركيز النيتريكسيد الذي تم الحصول عليه في درجات حرارة منخفضة في الخلايا الخام 264.7 بعد التحفيز مع PMA هو أيضاً مخفف في وجود ديسموتيز أكسيد فائق يتفق مع بيانات درجة حرارة الغرفة.يتم زيادة تركيز النيتريكسيد في الدم والسوائل القصبات من الفئران البليو والفئران المعالجة، وكذلك داخل supernatants من قطع أنسجة الرئة المحاجزة من الفئران البليلو والحيوانات المصابة، مقارنة بالضوابط التي يعاملها برنامج تلفزيوني. وعلاوة على ذلك، بعد حقن مسبار الدوران المداري الرجعي، تظهر فئران بيلو والحيوانات المعالجة إشارة تحقيق دوران أعلى مقارنة بالضوابط. وستتيح هذه البروتوكولات العملية للباحثين اختبار إنتاج الجذور الحرة في مقصورات خلوية مختلفة وعينات بيولوجية من قبل EPR، بما في ذلك قياسات درجات الحرارة المنخفضة.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

إزالة واستبدال الليغندات الذاتية من البروتينات والمواد المسببة للحساسية المرتبطة بالدهون

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...