Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af University of Colorado School of Medicine Deans strategiske forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 og 1R35HL139726-01, at E.N.G. og UCD CFReT fellowship award, (han). Forfatterne takke Dr. Sandra Eaton og Dr. Gareth Eaton (universitetet i Denver), Dr. Gerald Rosen og Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), og Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) til nyttige diskussioner og Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie og Ivy McDermott (University of Colorado Denver) for teknisk support.

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Colorado Denver institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af reagenser
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA) bestand (150 mM)
	<ol>
<li>Tilføje 2,95 g DTPA (393.35 g/mol) til 10 mL deioniseret vand.</li>
		<li>At opløse DTPA, tilføje 1 M NaOH dråbevis og bringe til en pH-værdi 7.0.</li>
		<li>Bringe lydstyrken til 50 mL med vand til en slutkoncentration DTPA på 150 mM, og opbevares ved 4 ?...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Vurdering af frie radikaler produktion i biologiske indstillinger er vigtig i forståelsen redox reguleret signalering i sundhed og sygdom, men et mål for disse arter er meget udfordrende på grund af den korte half-life af frie radikaler arter og tekniske begrænsninger med almindeligt anvendte metoder. EPR er en værdifuld og kraftfulde værktøj i redox biologi, da det er den kun entydige metode til påvisning af frie radikaler. I dette projekt, vi vise praktiske EPR metoder til at designe eksperimenter og prøver at...

Mens oxidativ stress og reaktive ilt arter er vigtige for studiet af forskellige sygdomme på tværs af alle organsystemer, er påvisning af reaktive ilt arter (ROS) udfordrende på grund af en kort halveringstid og høj reaktivitet. En elektron paramagnetisk resonans (EPR) teknik er den mest utvetydige metode til påvisning af frie radikaler. Spin sonder har fordele frem for de mere almindeligt brugte fluorescerende sonder. Selvom fluorescerende sonder er relativt billig og nem at bruge og giver hurtige, følsomme påvisning af ROS, har de alvorlige begrænsninger på grund af kunstig signaler, manglende evne til at beregne ROS koncentrationer, og en generel mangel på specificitet1 .
For at lette anvendelsen af EPR til biologiske undersøgelser, en bred vifte af spin sonder har været syntetiseret, der kan måle en række biologisk relevante frie radikaler arter samt pO2, pH og redox hedder2,3, 4,5,6,7. Spin traps har også udviklet til at fange kortlivede radikaler og form long-levende adukter, hvilket muliggør detektion ved EPR8. Begge klasser (spin sonder og spin traps) har fordele og begrænsninger. Almindeligt anvendte klasser i spin sonder er cyklisk hydroxylamines, som er EPR-tavs og reagere med kortvarig radikaler til at danne en stabil nitroxide. Cyklisk hydroxylamines reagerer med superoxid 100 gange hurtigere end spin traps, gør det muligt for dem at konkurrere med cellulære antioxidanter, men de mangler specificitet og har brug for passende kontrol og hæmmere at identificere radikale arter eller kilde ansvarlig for nitroxide signal. Mens spin fælder udstille specificitet, med særskilte spektrale mønstre afhængig af de fangne arter, de har langsom kinetik for superoxid spin diffusering og er udsat for bionedbrydning af radikale adukter. Ansøgninger om spin fældefangst har været veldokumenteret i biomedicinsk forskning9,10,11,12,13.
Målet med dette projekt er at demonstrere praktisk EPR metoder til at designe eksperimenter og prøver at opdage superoxid ved hjælp af spin sonder i forskellige cellulære rum in vitro og i forskellige væv rum i vivo. Flere manuskripter er offentliggjort protokollerne relevante for disse mål, ved hjælp af celle-gennemtrængelige, celle-vandtætte og mitokondriel målrettede spin sonder til forskellige cellulære rum i vitro og proces målvæv for analyse i musemodeller 14 , 15. vi bygge videre på dette organ af litteratur ved at validere en tilgang til at måle superoxid ved hjælp af en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonde i forskellige cellulære rum i vitro for at sikre nøjagtig målinger, fremhæve eventuelle tekniske problemer, som kan give en skævhed resultater. Vi leverer også metoder til at udføre EPR målinger i blod, bronchoalveolar lavage væske og lungevæv ved hjælp af CMH spin sonde. Disse undersøgelser sammenligne forskellige metoder til at behandle væv samt præsentere en metode til at injicere en anden spin sonde, CPH, ind i musene før høst væv. Endelig vil udvikle vi en praktisk metode til at gemme prøver i polytetrafluorethylen (PTFE) slanger at give mulighed for lagring og overførsel af prøver før EPR målinger på 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Præcis og specifik påvisning af reaktive ilt arter (ROS) i forskellige cellulære og væv rum er afgørende for studiet af redox-regulerede signalering i biologiske indstillinger. Elektron paramagnetisk resonans-spektroskopi (EPR) er den eneste direkte metode til at vurdere frie radikaler utvetydigt. Dens fordel er at det registrerer fysiologiske niveauer af specifikke arter med en høj specificitet, men det kræver specialiseret teknologi, omhyggelig prøveforberedelsen og passende kontrol for at sikre præcis fortolkning af data. Cyklisk hydroxylamin spin sonder reagerer selektivt med superoxid eller andre radikale til at generere en nitroxide signal, at kan kvantificeres ved EPR spektroskopi. Celle-gennemtrængelige spin sonder og spin sonder designet til at ophobe sig hurtigt i mitokondrierne mulighed for bestemmelse af superoxid koncentration i forskellige cellulære rum.
I dyrkede celler, brug af celle permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) langs med og uden celle-vandtætte Superoxid dismutase (SOD) forbehandling eller anvendelse af celle-gennemtrængelige PIND-SOD, giver mulighed for at differentiering af ekstracellulære fra cytosole superoxid. Den mitokondrielle 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) giver mulighed for måling af mitokondrie ROS (overvejende superoxid).
Spin sonder og EPR spektroskopi kan også anvendes til i vivo modeller. Superoxid kan påvises i ekstracellulære væske som blod og alveolær væske samt væv såsom lungevæv. Flere metoder præsenteres for at behandle og opbevare væv for EPR målinger og levere intravenøs 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonde in vivo. Mens målinger kan udføres ved stuetemperatur, kan prøver fra in vitro- og i vivo modeller også opbevares ved-80 ° C og analyseret af EPR på 77 K. Prøverne kan gemmes i specialiserede slanger stabile ved-80 ° C og køre på 77 K til at aktivere en praktisk, effektiv, og reproducerbar metode, der letter lagring og overførsel prøver.

Superoxid påvisning ved hjælp af CMH blev valideret ved hjælp af X / XO superoxid generering system til at demonstrere, at nitroxide (CM.) signal var fuldt hæmmes af SOD, mens katalase havde ingen effekt (figur 1A). Den samlede, ekstracellulære superoxid blev derefter evalueres i RAW 264.7 celler af kvægbruget celler med celle-gennemtrængelige CMH spin sonden +/-SOD forbehandling. Nitroxide-koncentrationen blev målt i både cellesuspension ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi er en entydig metode til at måle frie radikaler. Brugen af selektive spin sonder giver mulighed for påvisning af frie radikaler i forskellige cellulære rum. Vi præsenterer en praktisk, effektiv metode til at indsamle biologiske prøver, som letter behandling, lagring og overførsel af prøver for EPR målinger.

Brug af elektron paramagnetisk resonans i biologiske prøver ved omgivende temperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Dysreguleret redox signalering er impliceret i patogenesen af forskellige sygdomme. Studiet af redox biologi kræver nøjagtig påvisning af reaktive iltarter i forskellige cellulære og vævsrum. EPR spektroskopi er den eneste metode, der måler frie radikaler utvetydigt.Denne protokol viser en praktisk metode til håndtering og opbevaring af biologiske prøver til EPR-spektroskopi. Disse protokoller illustrerer brugen af EPR- og spinsonder i to repræsentative modeller. Selv om de kan tilpasses til at evaluere de aktive arter i andre biologiske miljøer.Eksperimentets udformning og håndteringen af prøven er afgørende for dets reproducerbarhed. Vi anbefaler, at man overvejer celletæthed og sikrer passende tidsmatchede kontroller. Begynd med forsigtigt at vaske rå 264,7 celler med en milliliter Krebs-Henseleit Buffer eller KHB, per brønd.Og behandle cellerne med 500 mikroliter KHB, suppleret med 100 mikromil DTPA per brønd. At forbehandle med superoxid dismutase, tilsæt 15 mikroliter af superoxid dismutase lager, eller køretøj, til hver brønd, og placere pladen på 37 grader Celsius i 10 minutter. Ved afslutningen af superoxid dismutase forbehandling, tilsæt 12,5 mikroliter af 10 millimolar CMH og 40 mikroliter af 125 micromolar PMA arbejdsopløsning til de relevante brønde, og inkubere ved 37 grader Celsius i 50 minutter.Læg straks pladerne på is og opsaml bufferen fra hver brønd til individuelle 1,5 milliliterrør på is. Dernæst tilsættes 100 mikroliter frisk KHB plus DTPA til hver brønd og skrab forsigtigt cellerne fra bunden af hver brønd. Derefter resuspenderet celle suspensioner med pipettering og overføre cellerne i individuelle 1,5 milliliter rør på is.Til superoxiddetektion ved stuetemperatur skal der første gang indlæses 50 mikroliter af en buffer eller celleprøve i et kapillærrør, og røret forsegles. Rørret straks i den elektromagnetiske paramagnetiske resonans eller EPR, spektrometeret, og angiv EPR-anskaffelsesparametrene for rumtemperaturmålinger. En blindprøve af buffer, der indeholder samme koncentration af sonde, der behandles under samme forsøgsbetingelser som en kontrol.For superoxid detektion ved 77 grader Kelvin, belastning 150 mikroliter af en prøve i en en til to tommer stykke lige polytetrafluorethylen, eller PTFE, slanger, med en gummi prop i den ene ende. Den anden ende af røret forsegles med endnu en prop, og flashfryser prøven i flydende nitrogen. Fjern derefter hurtigt propperne og læg PTFE-slangen i en mærket kryotube til opbevaring af flydende nitrogen.Ved EPR-målinger udfyldes fingervængningswaren for EPR-spektrometeret med flydende nitrogen, og PTFE-slangen, der indeholder prøven, anbringes i det flydende nitrogen. Anvend fingerdewaren i EPR-spektrometeret, og indstil EPR-anskaffelsesparametrene for målinger til 77 grader Kelvin. Til ROS-påvisning i frossen lungevæv skal vævet på tøris placeres og bruges en pincet til at stabilisere det flashfrosne væv på tøris.Prøven skæres i fem 15 milligram stykker, og vejes stykkerne i en tjæret 1,5 milliliter rør. Der tilsættes 196 mikroliter KHB plus DTPA og fire mikroliter CMH til prøven, og lungeprøven inkuberes i en time i et 37 grader Celsius-vandbad, før vævsfragmenterne pelleteres med en kort centrifugering. Prøven anbringes derefter på is, før 150 mikroliter af supernatanten overføres til et stykke PTFE-slanger til flashfrysning som forberedelse til EPR-måling som netop påvist.En vurdering af den samlede superoxidproduktion i rå 264,7 celler, der stimuleres med PMA som påvist, viser, at nitroxiidkoncentrationen i både cellesuspensionen og pufferen af de PMA-behandlede celler er den samme på grund af spinsondens gennemtrængelige karakter og hurtige ækvilibrering. Nitroxiid radikaler signal stigninger i rå 264.7 celler stimuleret med PMA, sammenlignet med kontrolceller, men ikke i celler forbehandlet med celle-uigennemtrængelig superoxid dismutase. Koncentrationen af nitroxid opnået ved lave temperaturer i rå 264,7 celler efter stimulation med PMA er også svækket i nærvær af superoxid dismutase i overensstemmelse med rumtemperatur data.Nitroxiidkoncentrationen øges i blodet og bronchoalveolar lavagevæsken hos blemus og behandlede mus samt i supernatanterne af høstede lungevævsstykker fra blemus og tilskadekomne dyr sammenlignet med PBS-behandlede kontroller. Yderligere, efter retro-orbital spin sonde injektion, bleo mus og behandlede dyr demonstrere en højere spin sonde signal i forhold til kontrol. Disse praktiske protokoller vil gøre det muligt for forskere at teste frie radikaler produktion i forskellige cellulære rum og biologiske prøver ved EPR, herunder lav temperatur målinger.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Forberedelse og<em&gt; In vivo</em&gt; Anvendelse af en aktivitetsbaseret Probe til<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid-amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse af β-Amyloid-induceret afvigelser Fibrin blodprop strukturen af spektroskopi og Scanning elektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokrystalelektrondiffraktion af små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...