Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Colorado-School van geneeskunde Dean's strategische onderzoeksinfrastructuur award, R01 HL086680-09 en 1R35HL139726-01, E.N.G. en UCD CFReT fellowship Award (HE). De auteurs bedanken Dr. Sandra Eaton en Dr. Gareth Eaton (Universiteit van Denver), Dr. Gerald Rosen en Dr. Joseph P. Kao (Universiteit van Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (Universiteit van Colorado Denver) voor nuttige discussies en Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie en Ivy McDermott (Universiteit van Colorado Denver) voor technische ondersteuning.

Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Colorado Denver institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic zuur (DTPA) voorraad (150 mM)
	<ol>
<li>Voeg 2,95 g DTPA (393.35 g/mol) tot 10 mL gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Te ontbinden DTPA, voeg 1 M NaOH ontkleuring en breng aan een pH van 7.0.</li>
		<li>Breng het volume aan 50 mL met water voor een eindconcentratie van DTPA van 150 mM,...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

De beoordeling van de productie van vrije radicalen in biologische instellingen is belangrijk in begrip redox geregeld signalering bij gezondheid en ziekte, maar de maatregel van deze soorten is zeer uitdagend vanwege de korte halfwaardetijd van vrije radicalen soorten en technische beperkingen met veelgebruikte methoden. EPR is een waardevolle en krachtige tool in de redox biologie, want het is de alleen ondubbelzinnig methode voor het opsporen van vrije radicalen. In dit project, tonen we praktische EPR methoden voor h...

Terwijl maatregelen van oxidatieve stress en reactieve zuurstof soorten belangrijk voor de studie van diverse ziekten over alle orgaansystemen zijn, is de detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) uitdagend als gevolg van een korte halfwaardetijd en hoge reactiviteit. Een elektron paramagnetisch resonantie (EPR) techniek is de meest duidelijke methode voor het opsporen van vrije radicalen. Spin sondes hebben voordelen ten opzichte van de meer gangbare TL sondes. Hoewel fluorescerende sondes zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te gebruiken en bieden snelle, gevoelige detectie van ROS, hebben ze ernstige beperkingen als gevolg van artefactuele signalen, een onvermogen om ROS concentraties, en een algemeen gebrek aan specificiteit1 te berekenen .
Ter vergemakkelijking van het gebruik van EPR voor biologische studies, een aantal spin sondes hebben al gesynthetiseerd die een aantal biologisch relevante vrije radicalen soorten, alsmede pO2, pH en redox meten kan staat2,3, 4,5,6,7. Spin traps zijn ook ontwikkeld om te vangen kortstondige radicalen en vorm lang-leven adducten, die detectie door EPR8vergemakkelijkt. Beide klassen (spin sondes en spin traps) hebben voordelen en beperkingen. Een veelgebruikte klasse van spin sondes zijn cyclische hydroxylamines, die zijn EPR-stille en reageren met kortstondige radicalen vormen een stabiele nitroxide. Cyclische hydroxylamines reageren met superoxide 100 keer sneller dan spin traps, inschakelen van hen om te concurreren met cellulaire antioxidanten, maar zij gebrek aan specificiteit en vereisen het gebruik van de passende controles en remmers radicale soorten of bron te identificeren verantwoordelijk voor het nitroxide signaal. Terwijl de spin traps tentoonstelling specificiteit, met verschillende spectrale dat patronen is afhankelijk van de gevangen soorten, ze hebben langzame kinetiek superoxide spin overlapping en zijn gevoelig voor biologische afbraak van de radicale adducten. Toepassingen voor overvulling van de spin zijn geweest goed gedocumenteerd in biomedisch onderzoek9,10,11,12,13.
Het doel van dit project is om aan te tonen van praktische EPR methoden voor het ontwerpen van experimenten en voorbereiding van monsters te detecteren superoxide met behulp van spin sondes in andere cellulaire compartimenten in vitro en in verschillende weefsels compartimenten in vivo. Verschillende manuscripten hebt protocollen die relevant zijn voor deze doelstellingen, met behulp van cel-permeabele, cel-ondoordringbaar en mitochondriale gerichte spin sondes naar andere cellulaire compartimenten in vitro en proces doelweefsel p.a. in muismodellen gepubliceerd 14 , 15. we voortbouwen op dit lichaam van literatuur door het valideren van een aanpak voor het meten van superoxide met behulp van een 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonde in het andere cellulaire compartimenten in vitro om ervoor te zorgen nauwkeurige metingen, benadrukken de mogelijke technische problemen kunnen vertekenen resultaten. Wij bieden ook methoden voor het uitvoeren van metingen van de EPR in bloed, bronchoalveolar lavage vloeistof en longweefsel met behulp van de CMH spin sonde. Deze studies vergelijken verschillende methoden voor het verwerken van de weefsels, alsmede het presenteren van een methode om een andere spin sonde, CPH, injecteren muizen vóór de oogst van weefsel. Ten slotte, ontwikkelen wij een praktische methode voor het opslaan van monsters in polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen te maken voor de opslag en overslag van monsters vóór EPR metingen op 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

De nauwkeurige en specifieke detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) in verschillende compartimenten voor cellulaire en weefsel is essentieel voor de studie van redox-gereglementeerde signalering in biologische instellingen. Elektron paramagnetisch resonantie spectroscopie (EPR) is de enige directe methode te beoordelen van vrije radicalen ondubbelzinnig. Het voordeel is dat fysiologische niveaus van specifieke soorten met een hoge specificiteit wordt gedetecteerd, maar het vereist gespecialiseerde technologie, zorgvuldige monstervoorbereiding en passende controles om ervoor te zorgen nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Cyclische hydroxylamine spin sondes reageren selectief met superoxide of andere radicalen voor het genereren van een nitroxide-signaal dat kan worden gekwantificeerd door EPR spectroscopie. Cel-permeabele spin sondes en spin sondes ontworpen snel ophopen in de mitochondriën toestaan voor de bepaling van superoxide concentratie in andere cellulaire compartimenten.
In gekweekte cellen, het gebruik van cel permeabele 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) samen met en zonder cel-ondoordringbare superoxide dismutase (SOD) voorbehandeling of gebruik van cel-permeabele PEG-SOD, voorziet in de differentiatie van extracellulaire van cytosolische superoxide. De mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) zorgt voor de meting van mitochondriale ROS (overwegend superoxide).
Spin sondes en EPR spectroscopie kunnen ook worden toegepast op de in vivo modellen. Superoxide kan worden opgespoord in extracellulaire vloeistoffen zoals bloed en alveolaire vloeistof, evenals weefsels zoals longweefsel. Verschillende methoden worden gepresenteerd voor het verwerken en opslaan van weefsel voor EPR metingen en leveren van intraveneuze 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonde in vivo. Terwijl metingen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, kunnen monsters verkregen van in vitro en in vivo modellen ook worden opgeslagen bij-80 ° C en geanalyseerd door EPR op 77 K. De monsters kunnen worden opgeslagen in gespecialiseerde buis stal bij-80 ° C en op 77 K om een praktische, efficiënte, en reproduceerbare methode die vergemakkelijkt opslaan en overdragen monsters worden uitgevoerd.

Superoxide detectie met behulp van CMH werd gevalideerd met behulp van de X / XO superoxide genereren systeem om aan te tonen dat de nitroxide (CM.)-signaal was volledig geremd door SOD, terwijl katalase had geen effect (figuur 1A). De totale, extracellulaire superoxide was het vervolgens geëvalueerd in RAW 264.7 cellen door drachtige cellen met de cel-permeabele CMH spin sonde +/-SOD voorbehandeling. De concentratie van de nitroxide werd gemeten ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Gedysregeerde redox signalering is betrokken bij de pathogenese van diverse ziekten. De studie van redoxbiologie vereist de nauwkeurige detectie van reactieve zuurstofsoorten in verschillende cellulaire en weefselcompartimenten. EPR spectroscopie is de enige methode die vrije radicalen ondubbelzinnig meet.Dit protocol toont een praktische methode voor het hanteren en opslaan van biologische monsters voor EPR-spectroscopie. Deze protocollen illustreren het gebruik van EPR- en spinsondes in twee representatieve modellen. Hoewel ze kunnen worden aangepast om de actieve soorten in andere biologische omgevingen te evalueren.Het ontwerp van het experiment en de behandeling van het monster zijn van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid ervan. We raden u aan de celdichtheid te overwegen en te zorgen voor de juiste tijdcontroles. Begin door ruwe 264.7 cellen met één milliliter van Krebs-Henseleit Buffer of KHB, per goed voorzichtig te wassen.En behandel de cellen met 500 microliters khb, aangevuld met 100 micromil DTPA per put. Om voorbehandeling met superoxide dismutase, voeg 15 microliter van superoxide dismutase voorraad, of voertuig, om elke put, en plaats de plaat op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg aan het einde van de voorbehandeling van superoxide dismutase toe, voeg 12,5 microliter van 10 millimolar CMH en 40 microliter van 125 micromolar PMA-werkoplossing toe aan de juiste putten en broed gedurende 50 minuten in de 37 graden Celsius.Plaats onmiddellijk de platen op ijs en verzamel de buffer van elke put in individuele 1,5 milliliter buizen op ijs. Voeg vervolgens 100 microliter verse KHB plus DTPA toe aan elke put en schraap de cellen voorzichtig van de bodem van elke put. Dan resuspend de cel suspenen met pipetting en breng de cellen in individuele 1,5 milliliter buizen op ijs.Voor superoxidedetectie bij kamertemperatuur laadt u eerst 50 microliter van één buffer of celmonster in een capillaire buis en sluit u de buis af. Plaats de buis onmiddellijk in de elektronenparamagnetische resonantie, of EPR, spectrometer en stel de EPR-acquisitieparameters in voor kamertemperatuurmetingen. Test altijd een leeg monster van buffer met dezelfde concentratie sonde behandeld onder dezelfde experimentele omstandigheden als een controle.Voor superoxide detectie op 77 graden Kelvin, laad 150 microliter van een monster in een een tot twee inch stuk van rechte polytetrafluorethyleen, of PTFE, buizen, met een rubberen stop aan de ene kant. Sluit het andere uiteinde van de buis af met een tweede stop en bevries het monster in vloeibare stikstof. Verwijder vervolgens snel de stoppers en plaats de PTFE-slang in een gelabelde cryotube voor opslag van vloeibare stikstof.Vul voor EPR-metingen de vingerdewar van de EPR-spectrometer met vloeibare stikstof en plaats de PTFE-buizen die het monster bevatten in de vloeibare stikstof. Plaats de vingerdewar in de EPR-spectrometer en stel de EPR-acquisitieparameters voor metingen in op 77 graden Kelvin. Voor ROS-detectie in bevroren longweefsel, plaats het weefsel op droog ijs en gebruik pincet om het flash-bevroren weefsel op droog ijs te stabiliseren.Snijd het monster in vijf 15 milligram stukken, en weeg de stukken in een geterde 1,5 milliliter buis. Voeg 196 microliters khb plus DTPA en vier microliters cmh toe aan het monster en broed het longmonster gedurende een uur in een 37 graden Celsius waterbad voordat de weefselfragmenten met een korte centrifugatie worden gepeld. Plaats vervolgens het monster op ijs voordat u 150 microliter van het supernatant overzet in een stuk PTFE-buizen voor het bevriezen van de flitser ter voorbereiding van epr-meting, zoals zojuist is aangetoond.Evaluatie van de totale productie van superoxide in ruwe 264,7 cellen gestimuleerd met PMA zoals aangetoond, toont aan dat de nitroxideconcentratie in zowel de celsuspensie als de buffer van de met PMA behandelde cellen vergelijkbaar is, vanwege de doorlaatbare aard en het snelle evenwicht van de spinsonde. De nitroxide radicalen signaal toeneemt in ruwe 264,7 cellen gestimuleerd met PMA, in vergelijking met controlecellen, maar niet in cellen voorbehandeld met cel-ondoordringbare superoxide dismutase. De concentratie nitroxide verkregen bij lage temperaturen in ruwe 264,7 cellen na stimulatie met PMA wordt ook verzwakt in aanwezigheid van superoxide dismutase in overeenstemming met de kamertemperatuurgegevens.De nitroxideconcentratie wordt verhoogd in het bloed en bronchoalveolaire lavagevloeistof van bleomuizen en behandelde muizen, evenals in de supernatants van geoogste stukjes longweefsel van bleo muizen en gewonde dieren, in vergelijking met PBS-behandelde controles. Verder, na retro-orbitale spin sonde injectie, bleo muizen en behandelde dieren tonen een hogere spin sonde signaal in vergelijking met controles. Deze praktische protocollen zullen onderzoekers in staat stellen om vrije radicalenproductie te testen in verschillende cellulaire compartimenten en biologische monsters door EPR, inclusief metingen van lage temperaturen.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...