Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
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Diese Arbeit wurde von der University of Colorado School of Medicine Dean strategische Forschungsinfrastruktur Award, R01 HL086680-09 und 1R35HL139726-01, zu eng und UCD CFReT Fellowship Award (er) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Sandra Eaton und Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen und Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), und Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) für hilfreiche Diskussionen und Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie und Ivy McDermott (University of Colorado Denver) für den technischen Support.

Alle Tierversuche wurden von der University of Colorado Denver institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic Säure (DTPA) Lager (150 mM)
	<ol>
<li>Fügen Sie 2,95 g DTPA (393.35 g/Mol) auf 10 mL entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Auflösen von DTPA, 1 M NaOH tropfenweise hinzufügen und bringen einem pH-Wert von 7,0.</li>
		<li>Bringen Sie die Lautstärke auf 50 mL mit Wasser für eine Endkonzen...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Die Bewertung der Produktion freier Radikale in den biologischen Einstellungen ist wichtig im Verständnis Redox geregelt Signalisierung in Gesundheit und Krankheit, aber das Maß dieser Arten ist sehr schwierig wegen der kurzen Halbwertszeit von freien Radikalen Arten und technische Einschränkungen mit häufig verwendeten Methoden. EPR ist eine wertvolle und mächtige Werkzeug in der Redox-Biologie, wie es die einzige eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. In diesem Projekt zeigen wir praktische EPR Met...

Maßnahmen der oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies sind, zwar wichtig für die Untersuchung von verschiedenen Krankheiten auf alle Organsysteme ist die Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch eine kurze Halbwertszeit und hohe Reaktivität anspruchsvoll. Eine Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Technik ist die am meisten eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. Spin-Sonden haben Vorteile gegenüber den häufig verwendeten fluoreszierenden Sonden. Obwohl fluoreszierende Sonden sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und ermöglichen eine schnelle, empfindliche Erkennung von ROS, haben sie gravierende Einschränkungen aufgrund Serums Signale, die Unfähigkeit, ROS Konzentration und einen allgemeinen Mangel an Spezifität1 berechnen .
Für eine einfache Handhabung des EPR für biologische Studien besagt eine Vielzahl von Spin Sonden synthetisiert worden, die eine Reihe von biologisch relevante radikalische Spezies sowie pO-2, pH und Redox messen können2,3, 4,5,6,7. Spin fallen auch entwickelt wurden, um kurzlebige radikale einzufangen und Form langlebige Addukte, die Erkennung von EPR8erleichtert. Beide Klassen (Spin-Sonden und Spin Traps) haben Vorteile und Einschränkungen. Eine häufig verwendete Klasse von Spin-Sonden sind zyklische Hydroxylamines, die EPR-Silent und reagieren mit kurzlebigen radikalen eine stabile Nitroxid bilden. Zyklische Hydroxylamines mit Superoxid 100 Mal schneller reagieren als Spin fallen, damit zu konkurrieren mit zellulären Antioxidantien, aber es fehlt Ihnen Spezifität und erfordern den Einsatz von geeigneten Kontrollen und Inhibitoren, die radikale Art oder Quelle zu identifizieren verantwortlich für das Nitroxid-Signal. Während Spin Ausstellung Spezifität Traps, Addukte mit unterschiedlichen spektralen Mustern je nach Gattung gefangen, sie haben langsame Kinetik für Superoxid spin überfüllen und sind anfällig für biologischen Abbau der radikalen. Anwendungen für Spin Überfüllung wurden gut dokumentiert in der biomedizinischen Forschung9,10,11,12,13.
Das Ziel dieses Projektes ist es, praktische EPR-Methoden für die Gestaltung von Experimenten zeigen und Probenvorbereitung, Superoxid mit Spin zu erkennen-Sonden in verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und in verschiedene Gewebe Fächer in Vivo. Mehrere Handschriften wurden Protokolle für diese Ziele mit Zelle durchlässig, Zelle-undurchlässig und mitochondriale gezielte Spin Sonden zu verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und Prozess Zielgewebe zur Analyse in Mausmodellen veröffentlicht. 14 , 15. Wir bauen auf diesem Körper der Literatur durch die Überprüfung eines Ansatzes zur Messung der Superoxid mittels 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) Spin Sonde in verschiedenen zellulären Kompartimenten in-vitro- um genau zu gewährleisten Messungen, Hervorhebung mögliche technische Probleme, die die Ergebnisse verzerren können. Wir bieten auch Methoden zum Ausführen von EPR-Messungen im Blut, alvéolaire Lavage Fluid und Lungengewebe mit der CMH-Spin-Sonde. Diese Studien vergleichen verschiedene Methoden, um Gewebe zu verarbeiten sowie eine Methode, um ein weiteres Spin-Sonde, CPH, in Mäuse vor der Ernte Gewebe injizieren zu präsentieren. Schließlich entwickeln wir eine praktische Methode zum Speichern von Proben in Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch ermöglicht die Speicherung und Übermittlung von Proben vor dem EPR-Messungen bei 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Die genaue und spezifische Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in verschiedenen Mobilfunk- und Gewebe Kompartimenten ist wichtig für die Untersuchung von Redox-regulierten Signalisierung in biologischen Einstellungen. Elektron-paramagnetische Resonanz-Spektroskopie (EPR) ist die einzige direkte Methode, um freie Radikale eindeutig zu beurteilen. Sein Vorteil ist, dass physiologische Ebenen von bestimmten Arten mit hoher Spezifität erkennt, aber es erfordert spezialisierte Technologie, sorgfältige Probenvorbereitung und entsprechende Kontrollen, um genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten. Zyklische Hydroxylamin Spin Sonden reagieren selektiv mit Superoxid oder andere radikale ein Nitroxid-Signal generieren, die von EPR-Spektroskopie quantifiziert werden können. Zelle durchlässig Spin Sonden und Spin Sonden entwickelt, um schnell in den Mitochondrien sammeln ermöglichen die Bestimmung der Superoxid-Konzentration in verschiedenen zellulären Kompartimenten.
In kultivierten Zellen, die Verwendung der Zelle durchlässig 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) zusammen mit und ohne Handy-undurchlässig Superoxid Dismutase (SOD) Vorbehandlung oder Verwendung der Zelle durchlässig PEG-SOD, ermöglicht die Differenzierung der extrazellulären aus cytosolischen Superoxid. Die mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] Piperidinium Paraquatdichlorid (Mito-TEMPO-H) ermöglicht die Messung von mitochondrialen ROS (überwiegend Superoxid).
Spin-Sonden und EPR-Spektroskopie können auch auf in Vivo Modelle angewendet werden. Superoxid kann in extrazellulären Flüssigkeiten wie Blut und alveoläre Flüssigkeit sowie Gewebe wie Lungengewebe erkannt werden. Verschiedene Methoden werden vorgestellt, um zu verarbeiten und speichern Gewebe für EPR-Messungen und intravenöse 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) Spin Sonde in Vivozu liefern. Während Messungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden können, können durch EPR bei 77 K. Proben aus in Vitro und in Vivo Modellen auch bei-80 ° C gelagert und analysiert werden Die Proben können in spezialisierten Schläuche stabil bei-80 ° C gelagert und laufen bei 77 K ermöglichen eine praktische, effiziente und reproduzierbare Methode, das erleichtert die Speicherung und Übertragung von Proben.

Superoxid-Erkennung mit CMH validiert wurde, mit dem X / XO Superoxid generieren System nachweisen können, dass das Nitroxid (CM.) Signal voll von SOD, gehemmt wurde, während die Katalase keinen Effekt (Abbildung 1A hatte). Total, extrazelluläre Superoxid wurde dann im RAW 264,7 Zellen durch Inkubation der Zellen mit der Zelle durchlässig CMH-Spin-Sonde + / SOD Vorbehandlung bewertet. Die Nitroxid-Konzentration wurde gemessen, in der Zellsuspen...

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Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Dysregulierte Redox-Signalisierung ist in die Pathogenese verschiedener Krankheiten involviert. Das Studium der Redoxbiologie erfordert den genauen Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies in verschiedenen Zell- und Gewebekompartimenten. Die EPR-Spektroskopie ist die einzige Methode, die freie Radikale eindeutig misst.Dieses Protokoll zeigt eine praktische Methode zur Handhabung und Lagerung von biologischen Proben für die EPR-Spektroskopie. Diese Protokolle veranschaulichen die Verwendung von EPR und Spinsonden in zwei repräsentativen Modellen. Obwohl sie angepasst werden können, um die aktiven Arten in anderen biologischen Umgebungen zu bewerten.Das Design des Experiments und der Umgang mit der Probe sind entscheidend für ihre Reproduzierbarkeit. Wir empfehlen, die Zelldichte zu berücksichtigen und geeignete zeitgerechte Kontrollen sicherzustellen. Beginnen Sie damit, roh 264,7 Zellen mit einem Milliliter Krebs-Henseleit-Puffer oder KHB pro Brunnen sanft zu waschen.Und behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikroliter KHB, ergänzt mit 100 Mikromil DTPA pro Brunnen. Um mit Superoxid-Dismutase zu pretreat, fügen Sie 15 Mikroliter Superoxid-Dismutase-Lager, oder Fahrzeug, zu jedem Brunnen, und legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Superoxid-Dismutase-Vorbehandlung 12,5 Mikroliter 10 Millimolar CMH und 40 Mikroliter 125 Mikromolar PMA Arbeitslösung zu den entsprechenden Brunnen hinzufügen, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten.Die Platten sofort auf Eis legen und den Puffer von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Rohre auf Eis sammeln. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter frischekhB plus DTPA zu jedem Brunnen hinzu und kratzen die Zellen vorsichtig von der Unterseite jedes Brunnens. Dann die Zellsuspensionen mit Pipetten wieder aufhängen und die Zellen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren auf Eis übertragen.Zur Superoxiddetektion bei Raumtemperatur zunächst 50 Mikroliter eines Puffers oder einer Zellprobe in ein Kapillarrohr laden und das Rohr versiegeln. Legen Sie das Rohr sofort in das Elektronen-Paramagnetresonanz- oder EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Raumtemperaturmessungen fest. Testen Sie immer eine leere Pufferprobe, die die gleiche Konzentration der Sonde enthält, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie eine Kontrolle behandelt wird.Für die Superoxiddetektion bei 77 Grad Kelvin 150 Mikroliter einer Probe in ein ein bis zwei Zoll großes Stück gerades Polytetrafluorethylen oder PTFE,-Schläuche, mit einem Gummistopfen an einem Ende laden. Versiegeln Sie das andere Ende des Rohres mit einem zweiten Stopfen und blitzen Sie die Probe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Entfernen Sie dann schnell die Stopfen und legen Sie die PTFE-Schläuche in ein beschriftetes Kryotube für die Lagerung flüssigen Stickstoffs.Für EPR-Messungen den Fingerdewar des EPR-Spektrometers mit flüssigem Stickstoff füllen und den PTFE-Schlauch, der die Probe enthält, in den flüssigen Stickstoff geben. Legen Sie den Fingerdewar in das EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Messungen auf 77 Grad Kelvin fest. Für den ROS-Nachweis im gefrorenen Lungengewebe legen Sie das Gewebe auf Trockeneis und verwenden Sie eine Pinzette, um das blitzgefrorene Gewebe auf Trockeneis zu stabilisieren.Schneiden Sie die Probe in fünf 15 Milligramm Stücke, und wiegen Sie die Stücke in einem geteerten 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie 196 Mikroliter KHB plus DTPA und vier Mikroliter CMH in die Probe ein, und inkubieren Sie die Lungenprobe für eine Stunde in einem 37 Grad Celsius Wasserbad, bevor Sie die Gewebefragmente mit einer kurzen Zentrifugation granulieren. Dann legen Sie die Probe auf Eis, bevor Sie 150 Mikroliter des Überstandes in ein Stück PTFE-Schläuche für das Einfrieren von Blitzen in Vorbereitung der EPR-Messung übertragen, wie gerade gezeigt.Die Auswertung der gesamten Superoxidproduktion in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert wurden, wie gezeigt, zeigt, dass die Nitroxidkonzentration sowohl in der Zellsuspension als auch im Puffer der PMA-behandelten Zellen aufgrund der durchlässigen Natur und des schnellen Gleichgewichts der Spinsonde ähnlich ist. Das Signal der Nitroxidradikale erhöht sich in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert werden, im Vergleich zu Kontrollzellen, aber nicht in Zellen, die mit zellunperinabler Superoxiddismutase vorbehandelt sind. Die Konzentration von Nitroxid, die bei niedrigen Temperaturen in rohen 264,7 Zellen nach Stimulation mit PMA gewonnen wird, wird auch in Gegenwart von Superoxiddismutase im Einklang mit den Raumtemperaturdaten abgeschwächt.Die Nitroxidkonzentration wird im Blut und bronchoalveolar Spülflüssigkeit von Bleo-Mäusen und behandelten Mäusen sowie innerhalb der Überwältigungen von geernteten Lungengewebestücken von Bleo-Mäusen und verletzten Tieren im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollen erhöht. Darüber hinaus zeigen Bleo-Mäuse und behandelte Tiere nach retroorbitaler Spinsondeninjektion ein höheres Spinsondensignal im Vergleich zu Kontrollen. Diese praktischen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Produktion freier Radikale in verschiedenen Zellkompartimenten und biologischen Proben durch EPR zu testen, einschließlich Niedrigtemperaturmessungen.

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