Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר באוניברסיטת קולורדו של רפואה דין פרס תשתיות מחקר אסטרטגי, R01 HL086680-09, 1R35HL139726-01, כדי E.N.G. ו- UCD CFReT מלגת פרס (הוא). המחברים תודה ד ר סנדרה איטון, ד ר גארת איטון (באוניברסיטת דנבר), ד ר ג'רלד רוזן, ד ר יוסף עמ' קאו (אוניברסיטת מרילנד), ד ר תהיה ונקאטרמאן (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) דיונים מועילים ואני ג'ואן Maltzahn, אשלי Trumpie, אייבי מקדרמוט (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) לקבלת תמיכה טכנית.

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו בדנוור אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. הכנת נוגדנים
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic חומצה (DTPA) מניות (150 מ"מ)
	<ol>
<li>להוסיף 2.95 גר' DTPA (393.35 g/mol) עד 10 מ"ל מים יונים.</li>
		<li>כדי להמיס DTPA, להוסיף 1 M NaOH dropwise ולהביא pH של 7.0.</li>
		<li>ל?...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

הערכת ייצור רדיקלים חופשיים בהגדרות ביולוגי חשוב להבין חמצון-חיזור מוסדר איתות על בריאות ומחלה, אבל המדד של המינים הללו הוא מאוד מאתגר בשל זמן מחצית החיים הקצר של רדיקלים חופשיים מינים וטכני מגבלות עם השיטות הנפוצות. EPR הוא כלי חשוב ורב עוצמה בביולוגיה חמצון-חיזור, כמו גם את שיטת ברורה וחד ...

בעוד אמצעים של סטרס חמצוני, מינים חמצן תגובתי חשובים בחקר מחלות מגוונות בכל מערכות איברים, הגילוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) הוא מאתגר עקב מחצית חיים קצר תגובתיות גבוהה. טכניקת פאראמגנטיים תהודה (EPR) אלקטרון הוא השיטה ברורה וחד משמעית ביותר לגילוי רדיקלים חופשיים. ספין הגששים יש יתרונות על פני הגששים פלורסנט הנפוצות. למרות הגששים פלורסנט הם יחסית זול וקל להשתמש ולספק גילוי מהיר, רגיש של ROS, יש להם מגבלות רציניות בשל אותות מלאכותית, חוסר יכולת לחשב ריכוזים ROS, וחוסר כללי ירידה לפרטים1 .
כדי להקל על השימוש של EPR עבור מחקרים ביולוגיים, מגוון רחב של ספין הגששים היו מסונתז שיכול למדוד מגוון מינים רדיקלים חופשיים ביולוגית רלוונטית וכן פו2, pH וחמצון-חיזור קובע2,3, 4,5,6,7. ספין מלכודות גם פותחו כדי ללכוד רדיקלים קצרת ימים, טופס ארוך-חי adducts, אשר מאפשר זיהוי על ידי EPR8. שני המעמדות (ספין הגששים ומלכודות ספין) יש יתרונות ומגבלות. שיעור נפוץ אחד של הגששים ספין הם hydroxylamines מחזורית, אשר EPR-שקט ו להגיב עם רדיקלים קצרת ימים כדי ליצור nitroxide יציב. Hydroxylamines מחזורית להגיב עם סופראוקסיד 100 פעמים מהר יותר מאשר מלכודות ספין, ומאפשרת להם להתחרות עם נוגדי חמצון הסלולר, אך הם חוסר ירידה לפרטים, דורשים שימוש הפקדים המתאימים, כדי לזהות את המינים רדיקלי או מקור אחראית על האות nitroxide. בעוד ספין מלכודות ירידה לפרטים מוצג עם ברורים ספקטרלי שדפוסי בהתאם המינים לכוד, יש להם קינטיקה איטי סופראוקסיד ספין השמנה, נוטים כילוי של הקיצוני adducts. יישומים עבור ספין השמנה כבר מתועדת היטב המחקר הביו-רפואי9,10,11,12,13.
המטרה של הפרויקט הזה היא להדגים שיטות מעשיות EPR לעיצוב ניסויים, הכנת דוגמאות כדי לזהות סופראוקסיד באמצעות ספין רגשים תאים סלולריים שונים בתוך חוץ גופית , רקמות שונות תאים ויוו. מספר כתבי יד פרסום פרוטוקולים רלוונטיים מטרות אלה, באמצעות ספין יישוב חדיר התא, התא אטום, מיטוכונדריאלי הגששים לרקמות היעד תאים סלולריים שונים במבחנה ואת תהליך לניתוח במודלים של העכבר 14 , 15. אנחנו בונים על הגוף הזה של הספרות על-ידי אימות גישה כדי למדוד סופראוקסיד באמצעות בדיקה ספין (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine תאים סלולריים שונים במבחנה כדי להבטיח מדויק מדידות, סימון בעיות פוטנציאליות טכני אשר עשויים להטות את תוצאות. כמו כן, אנו מספקים שיטות לביצוע מדידות EPR ב דם נוזל שטיפה bronchoalveolar, רקמת הריאה באמצעות המכשיר ספין CMH. מחקרים אלה השוואה בין שיטות שונות כדי לעבד את הרקמות, כמו גם להציג שיטה להזריק עוד ספין הגישוש, CPH, לתוך עכברים לפני קצירת רקמות. לבסוף, אנו מפתחים שיטה מעשית כדי לאחסן דגימות אבובים טפלון (PTFE) כדי לאפשר אחסון והעברת דגימות לפני EPR מדידות-77 K...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

זיהוי מדויק וספציפי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתאים הסלולר ורקמות שונים חיוני למחקר של חמצון-חיזור מוסדר איתות בהגדרות ביולוגי. ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא השיטה רק ישיר כדי להעריך רדיקלים חופשיים חד משמעית. היתרון שלו הוא שהוא מזהה רמות הפיזיולוגיות של מינים ספציפיים עם ירידה לפרטים גבוה, אבל זה דורש טכנולוגיה מיוחדת, הכנת הדוגמא זהיר, ולהבטיח הפקדים המתאימים לפירוש מדויק של הנתונים. Hydroxylamine מחזורית ספין הגששים להגיב באופן סלקטיבי סופראוקסיד או אחרים רדיקלים ליצירת אות nitroxide זה ניתן לכמת על ידי EPR ספקטרוסקופיה. ספין תא חדיר הגששים וזונדים ספין שנועד לצבור במהירות בתוך המיטוכונדריה לאפשר קביעת ריכוז סופראוקסיד בתאים הסלולר שונה.
תאים בתרבית, השימוש הסלולרי חדיר 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) יחד עם וללא תא אטום סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) רעלני או השימוש תא חדיר פג-SOD, מאפשר הבידול של חוץ-תאי של סופראוקסיד cytosolic. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido מיטוכונדריאלי] piperidinium dichloride (mito-טמפו-H) מאפשר מדידה של ROS מיטוכונדריאלי (בעיקר סופראוקסיד).
ניתן להחיל ספין הגששים וספקטרוסקופיה EPR גם למודלים ויוו . סופראוקסיד יכול להתגלות חוץ-תאית נוזלים כגון דם ונוזלי מכתשי, כמו גם רקמות כגון רקמת הריאה. מספר שיטות מוצגים לעבד, לאחסן רקמות למדידות EPR ולהעביר תוך ורידי 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) ספין המקדח בתוך vivo. בזמן מדידות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, המתקבל במבחנה ויוו דגמים יכול גם להיות מאוחסן ב- 80 ° C ודוגמאות נותחו על ידי EPR-77 K... הדגימות יכול להיות מאוחסנת באורווה צינורות מיוחדים ב-80 מעלות צלזיוס ולהפעיל ב K 77 כדי לאפשר מעשית, יעיל, ושיטה לשחזור מקלה על אחסון, העברת דגימות.

איתור סופראוקסיד CMH אומתה באמצעות ה-X / הקמב ץ סופראוקסיד יצירת מערכת כדי להדגים כי האות nitroxide (ס. מ..) היה מלא מעוכבים על ידי SOD, בעוד קטלאז היו אין השפעה (איור 1 א'). סופראוקסיד סה כ, חוץ-תאית הוערך אז בתאים 264.7 גלם על ידי תאים ומוכנסות עם החללית ספין CMH תא חד...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

איתות דיסווסוקס מחדש מעורב בפתוגנזה של מחלות מגוונות. המחקר של ביולוגיה redox דורש זיהוי מדויק של מינים חמצן תגובתי בתאי תאים ורקמות שונים. ספקטרוסקופיה EPR היא השיטה היחידה המודדת רדיקלים חופשיים באופן חד משמעי.פרוטוקול זה מדגים שיטה מעשית לטיפול ואחסון של דגימות ביולוגיות לספקטרוסקופיה EPR. פרוטוקולים אלה ממחישים את השימוש בבדיקות EPR וספין בשני מודלים מייצגים. למרות שהם יכולים להיות מותאמים כדי להעריך את המינים הפעילים במסגרות ביולוגיות אחרות.תכנון הניסוי והטיפול בדגימה הם קריטיים לשחזורו. אנו ממליצים לשקול את צפיפות התאים ולהבטיח פקדים מתאימים תואמי זמן. התחל על ידי שטיפת עדין של 264.7 תאים גולמיים עם מיליליטר אחד של מאגר קרבס-Henseleit או KHB, לבא.ולטפל בתאים עם 500 microliters של KHB, בתוספת 100 micromil של DTPA לבא. כדי להתמודד עם סופראוקסיד דיסמוטאז, להוסיף 15 microliters של מלאי סופראוקסיד דיסמוטאז, או רכב, לכל באר, ולה מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף טיפול מקדים סופראוקסיד דיסמוטאז, להוסיף 12.5 microliters של 10 CMH מילימולרית ו 40 microliters של 125 פתרון עבודה PMA מיקרומולרי ל הבארות המתאימות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות.מיד מניחים את הצלחות על קרח ולאסוף את החיץ מכל באר לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של KHB טרי בתוספת DTPA לכל באר בעדינות לגרד את התאים מתחתית כל באר. לאחר מכן תן שימוש חוזר במתלי התא עם צינורות והעבר את התאים לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר על קרח.לגילוי סופראוקסיד בטמפרטורת החדר, תחילה לטעון 50 microliters של חיץ אחד או מדגם תא לתוך צינור נימי ולאטום את הצינור. מיד למקם את הצינור לתוך תהודה paramagnetic אלקטרון, או EPR, ספקטרומטר ולהגדיר את הפרמטרים רכישת EPR עבור מדידות טמפרטורת החדר. בדוק תמיד מדגם ריק של מאגר המכיל את אותו ריכוז של בדיקה שטופלה באותם תנאים ניסיוניים כמו בקרה.לגילוי סופראוקסיד ב 77 מעלות קלווין, לטעון 150 microliters של מדגם אחד לתוך חתיכה אחת עד שתיים אינץ 'של polytetrafluoroethylene ישר, או PTFE, צינורות, עם פקק גומי בקצה אחד. לאטום את הקצה השני של הצינור עם פקק שני פלאש להקפיא את המדגם בחנקן נוזלי. לאחר מכן הסר במהירות את הפקקים והנח את צינורות PTFE בקריפטוטובה מסומנת לאחסון חנקן נוזלי.למדידות EPR, מלאו את האצבע של ספקטרומטר EPR בחנקן נוזלי והניחו את צינורות PTFE המכילים את הדגימה בחנקן הנוזלי. מקם את דיואר האצבע בספקטרומטר EPR והגדר את פרמטרי רכישת EPR למדידות ב- 77 מעלות קלווין. לגילוי ROS ברקמת ריאה קפואה, מניחים את הרקמה על קרח יבש ולהשתמש פינצטה כדי לייצב את הרקמה קפואה פלאש על קרח יבש.חותכים את הדגימה לחמש חתיכות 15 מיליגרם, ולשקול את החלקים בצינור מוכתם 1.5 מיליליטר. הוסף 196 microliters של KHB בתוספת DTPA וארבעה microliters של CMH לדגימה, ולהדגיר את דגימת הריאות במשך שעה אחת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני pelleting שברי הרקמה עם צנטריפוגה קצרה. לאחר מכן מניחים את המדגם על קרח לפני העברת 150 microliters של supernatant לתוך חתיכת צינורות PTFE להקפאת פלאש כהכנה של מדידת EPR כפי שהודגם רק.הערכה של ייצור סופראוקסיד הכולל בתאים גולמיים 264.7 מגורה עם PMA כפי שהוכח, מגלה כי ריכוז nitroxide הן המתלה התא ואת המאגר של תאים שטופלו PMA דומה, בשל הטבע חדיר שיווי משקל מהיר של החללית ספין. רדיקלים nitroxide אות עליות בתאים גולמיים 264.7 מגורה עם PMA, בהשוואה לתאי בקרה, אבל לא בתאים מטופלים מראש עם תאים בלתי חדירים סופראוקסיד ביסמוטאז. הריכוז של nitroxide המתקבל בטמפרטורות נמוכות בתאים גולמיים 264.7 לאחר גירוי עם PMA הוא גם התמת בנוכחות סופראוקסיד סיסמוטאז עולה בקנה אחד עם נתוני טמפרטורת החדר.ריכוז הניטרוקסיד גדל בדם ובנוזל לוויתן ברונכואלוולאר של עכברי בלו ועכברים מטופלים, כמו גם בתוך העל-טבעיים של חתיכות רקמת ריאה שנקטפו מעכברי בלו ובעלי חיים פצועים, בהשוואה לפקדים שטופלו ב- PBS. יתר על כן, לאחר הזרקת גשושית ספין מסלולית רטרו, עכברי בלו ובעלי חיים מטופלים מדגימים אות גשושית ספין גבוה יותר בהשוואה לפקדים. פרוטוקולים מעשיים אלה יאפשרו לחוקרים לבחון ייצור רדיקלים חופשיים בתאים סלולריים שונים ודגימות ביולוגיות על ידי EPR, כולל מדידות טמפרטורה נמוכה.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...