Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

इस कार्य के लिए विश्वविद्यालय के कोलोराडो स्कूल ऑफ मेडिसिन के डीन के रणनीतिक अनुसंधान अवसंरचना पुरस्कार, R01 HL086680-09 और 1R35HL139726-01 के लिए E.N.G. और UCD CFReT फेलोशिप पुरस्कार (वह) का समर्थन किया गया. लेखक डॉ सैंड्रा ईटन और dr. गैरेथ ईटन (डेनवर विश्वविद्यालय), डॉ गेराल्ड Rosen और डॉ यूसुफ पी काओ (मैरीलैंड विश्वविद्यालय), और डॉ सुजाता वेंकटरमण (कोलोराडो डेनवर विश्वविद्यालय) के लिए उपयोगी विचार विमर्श के लिए धंयवाद, और Joanne Maltzahn, एशले Trumpie और आइवी McDermott (कोलोराडो विश्वविद्यालय डेनवर) तकनीकी सहायता के लिए ।

सभी पशु अध्ययन कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. रिएजेंट्स की तैयारी
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic एसिड (DTPA) शेयर (१५० mM)
	<ol>
<li>DTPA के २.९५ ग्र?...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

जैविक सेटिंग्स में नि: शुल्क कट्टरपंथी उत्पादन का आकलन स्वास्थ्य और रोग में redox विनियमित संकेत को समझने में महत्वपूर्ण है, लेकिन इन प्रजातियों का माप मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों और तकनीकी के छोटे आधे ज?...

जबकि ऑक्सीडेटिव तनाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उपाय सभी अंग प्रणालियों में विविध रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के एक छोटे आधे जीवन और उच्च जेट के कारण चुनौतीपूर्ण है । एक इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) तकनीक मुक्त कण का पता लगाने के लिए सबसे अस्पष्ट तरीका है । स्पिन जांच अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच पर लाभ है । हालांकि फ्लोरोसेंट जांच अपेक्षाकृत सस्ती और आसानी से उपयोग कर रहे है और तेजी से, ROS के प्रति संवेदनशील का पता लगाने, वे गंभीर artifactual संकेतों की वजह से सीमाएं हैं, एक ROS सांद्रता की गणना करने में असमर्थता, और विशिष्टता 1 की एक सामांय कमी .
जैविक अध्ययन के लिए EPR के उपयोग की सुविधा के लिए, स्पिन जांच की एक किस्म है कि तार्किक प्रासंगिक मुक्त कट्टरपंथी प्रजातियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीओ2, पीएच, और redox राज्यों2,3 की एक सीमा को मापने कर सकते है संश्लेषित किया गया है 4,5,6,7. स्पिन जाल भी कम रहने वाले कण और फार्म का लंबे समय से रहने वाले adducts है, जो8EPR द्वारा पता लगाने की सुविधा को पकड़ने के लिए विकसित किया गया है । दोनों वर्गों (स्पिन जांच और स्पिन जाल) फायदे और सीमाएं हैं । एक आमतौर पर स्पिन की जांच की कक्षा का इस्तेमाल चक्रीय hydroxylamines, जो EPR मूक और कम के साथ प्रतिक्रिया कर रहे है एक स्थिर nitroxide फार्म के कण रहते हैं । चक्रीय hydroxylamines सुपरऑक्साइड १०० बार स्पिन जाल से अधिक तेजी के साथ प्रतिक्रिया, उन्हें सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए सक्षम करने, लेकिन वे विशिष्टता की कमी है और कट्टरपंथी प्रजातियों या स्रोत की पहचान करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण और अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता nitroxide संकेत के लिए जिंमेदार है । जबकि स्पिन जाल प्रदर्शित विशिष्टता, फंसे प्रजातियों के आधार पर अलग वर्णक्रमीय पैटर्न के साथ, वे सुपरऑक्साइड स्पिन फँसाने के लिए धीमी गति से कैनेटीक्स है और कट्टरपंथी adducts के biodegradation के लिए प्रवण हैं । स्पिन ट्रैपिंग के लिए आवेदन अच्छी तरह से किया गया है बायोमेडिकल रिसर्च9,10,11,12,13में प्रलेखित ।
इस परियोजना का लक्ष्य है प्रयोग डिजाइन करने के लिए व्यावहारिक EPR तरीकों को प्रदर्शित करना और नमूनों की तैयारी के लिए सुपरऑक्साइड में अलग सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच का उपयोग करने के लिए और vivoमें अलग ऊतक डिब्बों में । कई पांडुलिपियों इन लक्ष्यों के लिए प्रासंगिक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है, सेल का उपयोग कर-पारगंय, सेल-अभेद्य, और mitochondrial लक्षित स्पिन जांच इन विट्रो में अलग सेलुलर डिब्बों और माउस मॉडलों में विश्लेषण के लिए प्रक्रिया ऊतक लक्ष्य 14 , 15. हम सुपरऑक्साइड को मापने के लिए एक दृष्टिकोण को मान्य करके साहित्य के इस शरीर पर निर्माण करते हैं एक 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) इन विट्रो में विभिन्न सेलुलर डिब्बों में स्पिन जांच सटीक सुनिश्चित करने के लिए माप, परिणाम तिरछा हो सकता है कि संभावित तकनीकी समस्याओं पर प्रकाश डाला । हम भी CMH स्पिन जांच का उपयोग कर रक्त, bronchoalveolar लेवेज द्रव, और फेफड़ों के ऊतकों में EPR माप प्रदर्शन करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं । इन अध्ययनों से ऊतकों को संसाधित करने के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना करते हैं और साथ ही एक अन्य स्पिन जांच, CPH, चूहों में कटाई के ऊतकों से पहले एक विधि पेश करते हैं । अंत में, हम एक व्यावहारिक विधि को polytetrafluoroethylene में नमूनों की दुकान (PTFE) टयूबिंग का भंडारण और EPR मापन से पहले नमूनों के हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित ७७ K ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

अलग सेलुलर और ऊतक डिब्बों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का सटीक और विशिष्ट पता लगाने जैविक सेटिंग्स में redox विनियमित संकेतन के अध्ययन के लिए आवश्यक है । इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (EPR) ही प्रत्यक्ष विधि को स्पष्ट रूप से मुक्त कण का आकलन है । इसका लाभ यह है कि यह एक उच्च विशिष्टता के साथ विशिष्ट प्रजातियों के शारीरिक स्तर का पता लगाता है, लेकिन यह विशेष प्रौद्योगिकी की आवश्यकता होती है, सावधान नमूना तैयारी, और उचित नियंत्रण डेटा की सटीक व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए. चक्रीय hydroxylamine स्पिन जांच सुपरऑक्साइड या अंय कण के साथ चुनिंदा एक nitroxide संकेत है कि EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा quantified किया जा सकता है उत्पंन प्रतिक्रिया । सेल-पारगंय स्पिन जांच और mitochondria में तेजी से जमा करने के लिए डिजाइन की गई स्पिन जांचें विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सुपरऑक्साइड एकाग्रता के निर्धारण के लिए अनुमति देती हैं ।
प्रसंस्कृत कोशिकाओं में, सेल पारगंय का उपयोग 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CMH) के साथ और बिना सेल-अभेद्य सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) का इलाज, या सेल का उपयोग-पारगंय खूंटी-वतन, के लिए अनुमति देता है cytosolic सुपरऑक्साइड से extracellular का विभेद । द mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2, 2, 6, 6-tetramethyl-piperidine, 1-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio) acetamido] piperidinium dichloride (मिळो-टेम्पो-एच) की माप के लिए अनुमति देता है mitochondrial ROS (मुख्य रूप से सुपरऑक्साइड) ।
स्पिन जांच और EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी को भी वीवो मॉडल में लागू किया जा सकता है । सुपरऑक्साइड ऐसे रक्त और वायुकोशीय द्रव के रूप में extracellular तरल पदार्थ में पता लगाया जा सकता है, साथ ही ऊतकों जैसे फेफड़ों के ऊतकों । कई तरीकों की प्रक्रिया और EPR माप के लिए ऊतक की दुकान और 1-hydroxy-3-carboxy-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine (CPH) विवो मेंस्पिन जांच देने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । जबकि माप कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जा सकता है, इन विट्रो में से प्राप्त नमूनों और vivo मॉडल में भी संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर EPR द्वारा विश्लेषण. नमूने विशेष टयूबिंग में संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c और ७७ K पर चलाने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल, और reproducible विधि है कि भंडारण और स्थानांतरित नमूनों की सुविधा को सक्षम करने के लिए ।

सुपरऑक्साइड CMH का उपयोग कर सत्यापित किया गया X/XO सुपरऑक्साइड उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है कि nitroxide (सेमी.) संकेत पूरी तरह से वतन से हिचक रहा था, जबकि catalase कोई प्रभाव न?...

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Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) स्पेक्ट्रोस्कोपी मुक्त कण को मापने के लिए एक अस्पष्ट विधि है । चुनिंदा स्पिन जांच का उपयोग अलग सेलुलर डिब्बों में मुक्त कण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । हम EPR माप के लिए उपचार, भंडारण, और स्थानांतरित करने की सुविधा है कि जैविक नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक व्यावहारिक, कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं ।

परिवेशी तापमान और ७७ K पर जैविक नमूनों में इलेक्ट्रॉन Paramagnetic अनुनाद का उपयोग

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

डिस्लैरेटेड रेडॉक्स सिग्नलिंग विविध रोगों के रोगजनन में फंसाया जाता है। रेडॉक्स बायोलॉजी के अध्ययन में विभिन्न सेलुलर और ऊतक डिब्बों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का सटीक पता लगाने की आवश्यकता है। ईपीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एकमात्र तरीका है जो मुक्त कणों को स्पष्ट रूप से मापता है।यह प्रोटोकॉल ईपीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए जीवविज्ञान नमूनों की हैंडलिंग और भंडारण के लिए एक व्यावहारिक विधि को दर्शाता है। ये प्रोटोकॉल दो प्रतिनिधि मॉडलों में ईपीआर और स्पिन जांच के उपयोग को दर्शाते हैं। हालांकि उन्हें अन्य जैविक सेटिंग्स में सक्रिय प्रजातियों का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।प्रयोग का डिजाइन और नमूने की हैंडलिंग इसकी प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। हम सेल घनत्व पर विचार करने और उचित समय-मिलान नियंत्रण सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं। धीरे से क्रेब्स-Henseleit बफर या KHB, प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर के साथ कच्चे २६४.७ कोशिकाओं को धोने से शुरू करो ।और केएचबी के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, जो डीटीपीए के 100 माइक्रोमिल के साथ अच्छी तरह से पूरक हैं। सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज के साथ प्रीट्रीट करने के लिए, प्रत्येक कुएं में सुपरऑक्साइड डिस्म्यूट्स स्टॉक, या वाहन के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज प्रीट्रीटमेंट के अंत में, 10 मिलीमोलर सीएमएच के 12.5 माइक्रोलीटर और 125 माइक्रोमोलर पीएमए के 40 माइक्रोलीटर उचित कुओं के लिए काम करने वाले समाधान को जोड़ें, और 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।तुरंत प्लेटों को बर्फ पर रखें और प्रत्येक कुएं से बफर को बर्फ पर व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में इकट्ठा करें। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में ताजा केएचबी प्लस डीटीपीए के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रत्येक कुएं के नीचे से कोशिकाओं को धीरे-धीरे परिमार्जन करें। फिर कोशिका निलंबन को पिपटिंग के साथ फिर से खर्च करें और कोशिकाओं को बर्फ पर व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए, पहले एक बफर या सेल नमूने के 50 माइक्रोलीटर को एक केशिका ट्यूब में लोड करें और ट्यूब को सील करें। तुरंत ट्यूब को इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक अनुनाद, या ईपीआर, स्पेक्ट्रोमीटर में रखें और कमरे के तापमान माप के लिए ईपीआर अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। हमेशा एक नियंत्रण के रूप में एक ही प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत इलाज की जांच की एक ही एकाग्रता युक्त बफर के एक खाली नमूने का परीक्षण करें ।77 डिग्री केल्विन पर सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए, एक छोर पर रबर डाट के साथ सीधे पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन, या पीटीएफई, ट्यूबिंग के एक से दो इंच के टुकड़े में एक नमूने के 150 माइक्रोलीटर लोड करें। एक दूसरे डाट के साथ ट्यूब के दूसरे छोर सील और फ्लैश तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज। फिर जल्दी से डाट को हटा दें और तरल नाइट्रोजन भंडारण के लिए एक लेबल क्रायोट्यूब में पीएफई ट्यूबिंग रखें।ईपीआर मापन के लिए, ईपीआर स्पेक्ट्रोमीटर की उंगली देवर को तरल नाइट्रोजन के साथ भरें और तरल नाइट्रोजन में नमूना युक्त पीएफई ट्यूबिंग रखें। उंगली देवर को ईपीआर स्पेक्ट्रोमीटर में रखें और माप के लिए ईपीआर अधिग्रहण पैरामीटर 77 डिग्री केल्विन पर निर्धारित करें। जमे हुए फेफड़ों के ऊतकों में ROS का पता लगाने के लिए, सूखी बर्फ पर ऊतक जगह है और चिमटी का उपयोग करने के लिए सूखी बर्फ पर फ्लैश जमे हुए ऊतक को स्थिर ।नमूना को पांच 15 मिलीग्राम टुकड़ों में काटें, और टुकड़ों को एक टारेड 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में तौलें। नमूने के लिए KHB प्लस DTPA के १९६ माइक्रोलीटर और सीएमएच के चार माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक संक्षिप्त अपकेंद्री के साथ ऊतक के टुकड़े गोली मारने से पहले एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक घंटे के लिए फेफड़ों के नमूने को इनक्यूबेट । फिर ईपीआर माप की तैयारी में फ्लैश फ्रीजिंग के लिए सुपरनेट के 150 माइक्रोलीटर को स्थानांतरित करने से पहले नमूना को बर्फ पर रखें जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है।पीएमए के साथ उत्तेजित कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में कुल सुपरऑक्साइड उत्पादन के मूल्यांकन से पता चलता है कि दोनों कोशिका निलंबन और पीएमए के बफर-इलाज कोशिकाओं के बफर में नाइट्रोऑक्साइड एकाग्रता समान है, पारगम्य प्रकृति और स्पिन जांच के तेजी से संतुलन के कारण । नाइट्रोक्साइड रेडिकल्स सिग्नल पीएमए के साथ उत्तेजित कच्चे २६४.७ कोशिकाओं में बढ़ जाती है, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, लेकिन कोशिका-अभेद्य सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज के साथ पूर्वनिर्धारण कोशिकाओं में नहीं । पीएमए के साथ उत्तेजना के बाद कच्चे 264.7 कोशिकाओं में कम तापमान पर प्राप्त नाइट्रोऑक्साइड की एकाग्रता भी कमरे के तापमान डेटा के अनुरूप सुपरऑक्साइड डिस्म्यूट की उपस्थिति में क्षीण हो जाती है।नाइट्रोक्साइड एकाग्रता रक्त और ब्रोंकोलवेओलर लावेज तरल पदार्थ में ब्लियो चूहों और इलाज चूहों के साथ-साथ पीबीएस-उपचारित नियंत्रणों की तुलना में ब्लियो चूहों और घायल जानवरों से काटे गए फेफड़ों के ऊतकों के टुकड़ों के सुपरनेटैंट के भीतर बढ़ जाती है। इसके अलावा, रेट्रो-ऑर्बिटल स्पिन प्रोब इंजेक्शन के बाद, ब्लियो चूहों और इलाज किए गए जानवर नियंत्रण की तुलना में उच्च स्पिन जांच संकेत प्रदर्शित करते हैं। ये व्यावहारिक प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कम तापमान मापन सहित ईपीआर द्वारा विभिन्न सेलुलर डिब्बों और जैविक नमूनों में मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन का परीक्षण करने की अनुमति देंगे ।

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