Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla University of Colorado at Scuola di medicina Dean di infrastrutture di ricerca strategiche award, R01 HL086680-09 e 1R35HL139726-01, al E.N.G e UCD CFReT premio fellowship (lui). Gli autori ringraziano il Dr. Sandra Eaton e Dr. Gareth Eaton (Università di Denver), Dr. Gerald Rosen e Dr. Joseph P. Kao (Università del Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) per utili discussioni e Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie e Ivy McDermott (University of Colorado Denver) per il supporto tecnico.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla University of Colorado Denver istituzionale Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>
Stock di diethylenetriaminepentaacetic acido (DTPA) (150 mM)
	<ol>
<li>Aggiungere 2,95 g di DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL di acqua deionizzata.</li>
		<li>Per dissolvere DTPA, aggiungere 1 M NaOH goccia a goccia e portare ad un pH di 7.0.</li>
		<li>Portare il volume a 50 mL con acqua per una concentrazione fi...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

La valutazione della produzione di radicali liberi nelle impostazioni biologiche è importante nella comprensione regolato segnalazione redox in salute e malattia, ma la misura di queste specie è estremamente impegnativo a causa della breve emivita di specie del radicale libero e tecnici limitazioni con metodi comunemente utilizzati. L'EPR è uno strumento prezioso e potente in biologia redox, poichè è il metodo solo non ambiguo per la rilevazione dei radicali liberi. In questo progetto, dimostriamo metodi EPR pratici...

Mentre misure dello sforzo ossidativo e specie reattive dell'ossigeno sono importanti per lo studio di diverse malattie attraverso tutti i sistemi dell'organo, la rilevazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è difficile a causa di una breve emivita e alta reattività. Una tecnica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) dell'elettrone è il metodo più inequivocabile per la rilevazione dei radicali liberi. Sonde di spin hanno vantaggi rispetto le sonde fluorescenti più comunemente utilizzati. Se sonde fluorescenti sono relativamente poco costoso e facile da usare e fornire rilevamento rapido, sensibile di ROS, hanno gravi limitazioni a causa di segnali artifactual, un'incapacità di calcolare le concentrazioni di ROS e una generale mancanza di specificità1 .
Per facilitare l'uso di EPR per gli studi biologici, una varietà di sonde sono stati sintetizzati di spin che può misurare una gamma di specie del radicale libero biologicamente rilevanti nonché pO2, pH e redox afferma2,3, 4,5,6,7. Trappole di spin sono stati sviluppati anche per catturare i radicali di breve durati e durata di vita-forma addotti, che facilita la rilevazione di EPR8. Entrambe le classi (sonde di spin e spin traps) hanno vantaggi e limitazioni. Una classe comunemente usata di sonde di spin sono idrossilammine ciclici, che sono EPR-silent e reagiscono con i radicali di breve durati per formare un nitrossidi stabile. Ciclici idrossilammine reagiscono con superossido 100 volte più veloce di spin trappole, consentendo loro di competere con gli antiossidanti cellulari, ma manca di specificità e richiedono l'uso di adeguati controlli e inibitori per identificare l'origine o specie radicaliche responsabile per il segnale di nitrossidi. Mentre spin intrappola espositivo specificità, con distinte spettrale che modelli a seconda della specie intrappolata, hanno cinetica lenta per spin trapping e sono incline a biodegradazione del radicale del superossido addotti. Applicazioni per il trapping spin sono state ben documentate nella ricerca biomedica9,10,11,12,13.
L'obiettivo di questo progetto è quello di dimostrare metodi EPR pratici per la progettazione di esperimenti e preparazione dei campioni per rilevare superossido utilizzando spin sonde in diversi compartimenti cellulari in vitro e nei compartimenti differenti del tessuto in vivo. Alcuni manoscritti sono pubblicati protocolli pertinenti a questi obiettivi, usando sonde di cellula-permeabile, impermeabile cellulare e mitocondriale spin mirati al tessuto bersaglio diversi compartimenti cellulari in vitro e processo per l'analisi in modelli murini 14 , 15. costruiamo su questo corpo di letteratura convalidando un approccio per misurare superossido utilizzando una sonda di spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine in diversi compartimenti cellulari in vitro per garantire accurata misurazioni, evidenziando potenziali problemi tecnici che possono falsare i risultati. Forniamo anche metodi per effettuare misurazioni di EPR in sangue, fluido di lavaggio broncoalveolare e tessuto polmonare utilizzando la sonda di spin CMH. Questi studi confrontare diversi metodi per elaborare i tessuti, nonché di presentare un metodo per iniettare un'altra sonda di spin, CPH, topi prima della raccolta del tessuto. Infine, sviluppare un metodo pratico per conservare i campioni in tubi di politetrafluoroetilene (PTFE) per consentire l'archiviazione e il trasferimento dei campioni prima di misurazioni EPR a 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

La rilevazione accurata e specifica delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in diversi compartimenti cellulari e tessutali è essenziale per lo studio di redox-regolati segnalazione in impostazioni biologiche. Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è il metodo solo diretto per valutare in modo non ambiguo i radicali liberi. Il suo vantaggio è che rileva i livelli fisiologici di specifiche specie con un'alta specificità, ma richiede tecnologia specializzata, preparazione del campione attento e controlli appropriati per garantire la corretta interpretazione dei dati. Sonde di spin ciclico idrossilammina reagiscono selettivamente con superossido o altri radicali per generare un segnale di nitrossidi che possa essere quantificato mediante spettroscopia EPR. Sonde di spin cellula-permeabile e sonde di spin progettati per accumulare rapidamente nei mitocondri consentono la determinazione della concentrazione di superossido in diversi compartimenti cellulari.
In cellule coltivate, l'uso di 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeabili delle cellule (CMH) lungo con e senza pretrattamento di cella-impermeabile superossido dismutasi (SOD) o uso di PEG-SOD cellula-permeabile, consente la differenziazione di extracellulare da superossido citosolico. Il 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondriale] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permette la misura di ROS mitocondriale (principalmente superossido).
Sonde di spin e spettroscopia EPR possono essere applicati anche ai modelli in vivo . Superossido può essere rilevato in fluidi extracellulari quali il sangue e liquido alveolare, così come tessuti, come tessuto polmonare. Diversi metodi sono presentati per elaborare e conservare il tessuto per misurazioni di EPR e consegnare endovenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotazione sonda in vivo. Mentre le misure possono essere eseguite a temperatura ambiente, campioni ottenuti da modelli in vitro e in vivo possono essere conservati a-80 ° C e analizzati da EPR a 77 K. I campioni possono essere memorizzati in stalla tubi specializzati a-80 ° C ed eseguiti a 77 K per consentire un pratico, efficiente e metodo riproducibile che facilita la memorizzazione e trasferimento di campioni.

Rilevamento di superossido utilizzando CMH è stata convalidata utilizzando la X / superossido XO generando sistema per dimostrare che il segnale di nitrossidi (CM..) completamente è stato inibito da SOD, mentre catalasi non ha avuto effetto (Figura 1A). Il superossido totale, extracellulare è stata quindi valutato in 264.7 celle grezze di incubazione le cellule con la sonda di spin CMH cellula-permeabile + /-pretrattamento di SOD. La concentrazi...

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Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L'utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l'archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

La segnalazione redox disregolata è implicata nella patogenesi di diverse malattie. Lo studio della biologia redox richiede il rilevamento accurato di specie reattive dell'ossigeno in diversi compartimenti cellulari e tissutali. La spettroscopia EPR è l'unico metodo che misura i radicali liberi in modo inequivocabile.Questo protocollo dimostra un metodo pratico per la gestione e la conservazione di campioni biologici per la spettroscopia EPR. Questi protocolli illustrano l'uso di EPR e sonde di spin in due modelli rappresentativi. Anche se possono essere adattati per valutare le specie attive in altri contesti biologici.La progettazione dell'esperimento e la manipolazione del campione sono fondamentali per la sua riproducibilità. Si consiglia di considerare la densità cellulare e garantire controlli adeguati e adeguati. Iniziare lavando delicatamente le cellule crude 264.7 con un millilitro di Krebs-Henseleit Buffer o KHB, per pozzo.E trattare le cellule con 500 microlitri di KHB, integrati con 100 micromil di DTPA per pozzo. Per pretrattare con superossido dismutasi, aggiungere 15 microlitri di materiale superossido dismutasi, o veicolo, a ciascun pozzo e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine del pretrattamento della superossido dismutasi, aggiungere 12,5 microlitri di CMH millimolare e 40 microlitri di soluzione di lavoro PMA micromolare 125 ai pozzi appropriati e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti.Posizionare immediatamente le piastre sul ghiaccio e raccogliere il tampone da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di KHB fresco più DTPA a ciascun pozzo e raschiare delicatamente le cellule dal fondo di ogni pozzo. Quindi rimospendare le sospensioni cellulari con pipettazione e trasferire le celle in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio.Per il rilevamento del superossido a temperatura ambiente, caricare prima 50 microlitri di un tampone o di un campione cellulare in un tubo capillare e sigillare il tubo. Posizionare immediatamente il tubo nella risonanza paramagnetica elettronica, o EPR, spettrometro e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni della temperatura ambiente. Testare sempre un campione vuoto di tampone contenente la stessa concentrazione di sonda trattata nelle stesse condizioni sperimentali di un controllo.Per il rilevamento del superossido a 77 gradi Kelvin, caricare 150 microlitri di un campione in un pezzo da uno a due pollici di politetrafluoroetilene dritto, o PTFE, tubi, con un tappo di gomma ad un'estremità. Sigillare l'altra estremità del tubo con un secondo tappo e lampeggiare congelare il campione in azoto liquido. Quindi rimuovere rapidamente i tappi e posizionare il tubo PTFE in un criotubo etichettato per lo stoccaggio dell'azoto liquido.Per le misurazioni dell'EPR, riempire il dewar delle dita dello spettrometro EPR con azoto liquido e posizionare i tubi PTFE contenenti il campione nell'azoto liquido. Posizionare il dewar delle dita nello spettrometro EPR e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni a 77 gradi Kelvin. Per il rilevamento del ROS nel tessuto polmonare congelato, posizionare il tessuto sul ghiaccio secco e utilizzare una pinzetta per stabilizzare il tessuto congelato dal flash sul ghiaccio secco.Tagliare il campione in cinque pezzi da 15 milligrammi e pesare i pezzi in un tubo tarato da 1,5 millilitri. Aggiungere 196 microlitri di KHB più DTPA e quattro microlitri di CMH al campione e incubare il campione polmonare per un'ora in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius prima di pellettare i frammenti di tessuto con una breve centrifugazione. Quindi posizionare il campione sul ghiaccio prima di trasferire 150 microlitri del supernatante in un pezzo di tubi PTFE per il congelamento flash in preparazione della misurazione EPR come appena dimostrato.La valutazione della produzione totale di superossido in 264,7 cellule grezze stimolate con PMA come dimostrato, rivela che la concentrazione di nitroxide sia nella sospensione cellulare che nel tampone delle cellule trattate con PMA è simile, a causa della natura permeabile e del rapido equilibrio della sonda di spin. Il segnale dei radicali nitroxide aumenta nelle cellule grezze 264,7 stimolate con PMA, rispetto alle cellule di controllo, ma non nelle cellule pretrattate con superossido impermeabile cellulare dismutasi. Anche la concentrazione di nitroxide ottenuta a basse temperature in cellule grezze 264,7 dopo stimolazione con PMA è attenuata in presenza di superossido dismutasi coerente con i dati sulla temperatura ambiente.La concentrazione di nitroxide è aumentata nel sangue e nel liquido di lavanda broncoalveolare dei topi bleo e dei topi trattati, nonché all'interno dei supernanti dei pezzi di tessuto polmonare raccolti da topi bleo e animali feriti, rispetto ai controlli trattati con PBS. Inoltre, dopo l'iniezione retro-orbitale della sonda di spin, i topi bleo e gli animali trattati dimostrano un segnale della sonda di spin più elevato rispetto ai controlli. Questi protocolli pratici consentiranno ai ricercatori di testare la produzione di radicali liberi in diversi compartimenti cellulari e campioni biologici da parte dell'EPR, comprese le misurazioni a bassa temperatura.

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