Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av University of Colorado skolen av medisin Dekanus strategisk forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 og 1R35HL139726-01, E.N.G. og UCD CFReT fellowship-prisen (han). Forfatterne takker Dr. Sandra Eaton og Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), og Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) for nyttig diskusjoner og Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie og Ivy McDermott (University of Colorado Denver) for kundestøtte.

Alle dyrestudier ble godkjent av University of Colorado Denver institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA) lager (150 mM)
	<ol>
<li>Legge 2,95 g av DTPA (393.35 g/mol) til 10 mL deionisert vann.</li>
		<li>Oppløse DTPA, legge til 1 M NaOH dropwise og bringe til en pH på 7.0.</li>
		<li>Bringe volumet til 50 mL med vann til en endelig DTPA konsentrasjon av 150 mM, og lagre på 4 ° C.</li>
	</...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Vurdering av frie radikaler produksjon biologiske innstillinger er viktig i forståelse redoks regulert signalering i helse og sykdom, men mål av disse artene er svært utfordrende grunnet den korte halveringstiden av frie radikaler arter og teknisk begrensninger med vanlige metoder. EPR er en verdifull og kraftig verktøy i redoks biologi, som det er den bare entydige metoden for påvisning av frie radikaler. Dette prosjektet, vi viser praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å oppdage ...

Mens tiltak av oksidativt stress og reaktive oksygen arter er viktig å studere ulike sykdommer over alle organsystemer, er gjenkjenning av reaktive oksygen arter (ROS) utfordrende en kort halveringstid og høy reaktivitet. Et elektron spinn resonans (EPR) teknikk er den mest entydig metoden for påvisning av frie radikaler. Spin sonder har fordeler fremfor de vanlige lysrør sonder. Fluorescerende sonder er relativt billig og enkel å bruke og gir rask, følsom påvisning av ROS, har de alvorlige begrensninger på grunn av artifactual signaler, en manglende evne til å beregne ROS konsentrasjoner, og en generell mangel på spesifisitet1 .
For å lette bruken av EPR for biologiske studier, en rekke spinn sonder har blitt syntetisert som kan måle en rekke biologisk relevante frie radikaler arter som pO2, pH og redoks sier2,3, 4,5,6,7. Spinn feller har også blitt utviklet for å fange kortvarig radikaler og skjemaet lang-levende addukter, noe som letter oppdagelsen av EPR8. Begge klassene (spin sonder og spinn feller) har fordeler og begrensninger. En vanlig klasse av spin sonder er syklisk hydroxylamines, som EPR stillegående og reagere med kortvarig radikaler å danne en stabil nitroxide. Syklisk hydroxylamines reagere med superoxide 100 ganger raskere enn spinn feller, slik at de kan konkurrere med mobilnettet antioksidanter, men de mangler spesifisitet og krever bruk av egnede kontroller og hemmere å identifisere radikale arter eller kilde ansvarlig for nitroxide signalet. Mens spinn feller utstillingen spesifisitet, med forskjellige spectral mønstre avhengig fanget arter, de har langsom kinetics for superoxide spinne overlapping og er utsatt for biologisk nedbrytning av addukter. Programmer for spin overlapping er godt dokumentert i biomedisinsk forskning,9,,10,,11,,12,,13.
Målet med dette prosjektet er å demonstrere praktiske EPR metoder for å designe eksperimenter og forbereder prøver å finne superoxide bruker spinn sonder i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og i ulike vev avdelinger i vivo. Flere manuskripter har publisert protokoller relevant for disse målene, celle-gjennomtrengelig, celle-ugjennomtrengelig og mitokondrie målrettet spinn sonder til forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro og prosessen vevet i analyse i musen modeller 14 , 15. vi bygge på denne mengde litteratur ved å validere en tilnærming for å måle superoxide bruker en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spinn sonde i forskjellige mobilnettet avdelinger i vitro for å sikre nøyaktig målinger, utheving potensielle tekniske problemer som kan forskyve resultatene. Vi tilbyr også metoder for å utføre EPR målinger i blod, bronchoalveolar lavage væske og lungevev ved hjelp av CMH spinn sonden. Disse studiene sammenligne ulike metoder for å behandle vev, samt presentere en metode for å injisere en annen spinn sonde, CPH, i mus før høsting vev. Til slutt, vi utvikle en praktisk metode for å lagre prøver i polytetrafluoroethylene (PTFE) rør for lagring og overføring av prøver før EPR målinger på 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Nøyaktig og bestemt påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i ulike cellular og vev rom er viktig å studere redoks regulert signalering i biologiske innstillinger. Elektron spinn resonans spektroskopi (EPR) er bare direkte metode å vurdere frie radikaler entydig. Dens fordel er at den oppdager fysiologiske nivåer av bestemte arter med en høy spesifisitet, men det krever spesialisert teknologi, forsiktig utvalg forberedelse og egnede kontroller å sikre nøyaktig tolkning av data. Syklisk hydroksylamin spinn sonder reagere selektivt superoxide eller andre radikale generere et nitroxide signal som kan kvantifiseres av EPR spektroskopi. Celle-permeable spinn sonder og spinn sonder utformet for å akkumulere raskt i mitokondrier tillate fastsettelse av superoxide konsentrasjon i forskjellige mobilnettet avdelinger.
I kulturperler celler, bruk av cellen permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) sammen med og uten celle-ugjennomtrengelig superoxide dismutase (TORV) forbehandling, eller bruk av celle-permeable PEG-TORV, gir den differensiering av ekstracellulære fra cytosolic superoxide. Mitokondrielt 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) tillater for måling av Mitokondrielt ROS (hovedsakelig superoxide).
Spin sonder og EPR spektroskopi kan også brukes i vivo modeller. Superoxide kan oppdages ekstracellulære væsker som blodet og alveolar væske, som vev som lungevev. Flere metoder er presentert for å lagre vev for EPR målinger og leverer intravenøs 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spinn sonde i vivo. Mens målinger kan utføres ved romtemperatur, kan prøver innhentet fra i vitro og vivo modeller også lagres ved-80 ° C og analyseres av EPR på 77 K. Eksemplene kan lagres i spesialiserte rør stall ved-80 ° C og kjøre på 77 K å aktivere en praktisk, effektiv, og reproduserbar metode som muliggjør lagring og overføring.

Superoxide detection bruke CMH ble validert ved hjelp av X / XO superoxide genererer systemet å demonstrere at nitroxide (CM.) signalet var fullt hemmet av TORV, mens catalase hadde ingen effekt (figur 1A). Den totale, ekstracellulære superoxide ble deretter evalueres i rå 264.7 celler av rugende celler med celle-permeable CMH spinn sonden +/-TORV forbehandling. Nitroxide konsentrasjonen ble målt i både celle suspensjon og buffer, som viste at...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron spinn resonans (EPR) spektroskopi er en entydig metode for å måle frie radikaler. Bruk av selektiv spinn sonder tillater påvisning av frie radikaler i forskjellige mobilnettet avdelinger. Vi presenterer en praktisk, effektiv metode for å samle biologiske prøver som forenkler behandling, lagring og overføring av prøver for EPR målinger.

Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Dysregulert redokssignalering er innblandet i patogenesen av ulike sykdommer. Studien av redoksbiologi krever nøyaktig påvisning av reaktive oksygenarter i forskjellige cellulære og vevsrom. EPR spektroskopi er den eneste metoden som måler frie radikaler utvetydig.Denne protokollen viser en praktisk metode for håndtering og lagring av biologiske prøver for EPR-spektroskopi. Disse protokollene illustrerer bruken av EPR- og spinnsonder i to representative modeller. Selv om de kan tilpasses for å evaluere de aktive artene i andre biologiske miljøer.Utformingen av eksperimentet og håndteringen av prøven er avgjørende for reproduserbarheten. Vi anbefaler at du vurderer celletetthet og sikrer passende tidstilpassede kontroller. Begynn med å vaske rå 264,7 celler forsiktig med en milliliter Krebs-Henseleit Buffer eller KHB, per brønn.Og behandle cellene med 500 mikroliter KHB, supplert med 100 mikromil DTPA per brønn. For å forbehandle med superoksiddismutase, legg til 15 mikroliter superoksiddismutase lager, eller kjøretøy, til hver brønn, og plasser platen på 37 grader Celsius i 10 minutter. På slutten av superoksiddismutaseforbehandlingen, tilsett 12,5 mikroliter på 10 millimolar CMH og 40 mikroliter på 125 mikromolar PMA-arbeidsløsning til de aktuelle brønnene, og inkuber ved 37 grader Celsius i 50 minutter.Legg umiddelbart platene på is og samle bufferen fra hver brønn til individuelle 1,5 milliliter rør på is. Deretter legger du til 100 mikroliter frisk KHB pluss DTPA til hver brønn og skraper forsiktig cellene fra bunnen av hver brønn. Deretter gjenbruker cellesuspensjonene med pipettering og overfører cellene til individuelle 1,5 milliliter rør på is.For superoksiddeteksjon ved romtemperatur, legg først 50 mikroliter av en buffer eller celleprøve inn i et kapillærrør og forsegle røret. Plasser umiddelbart røret i elektronparamagnetisk resonans, eller EPR, spektrometer og sett EPR-oppkjøpsparametrene for romtemperaturmålinger. Test alltid en tom prøve av buffer som inneholder samme konsentrasjon av sonde behandlet under de samme eksperimentelle forholdene som en kontroll.For superoksiddeteksjon ved 77 grader Kelvin, last 150 mikroliter av en prøve i en en til to tommers stykke rett polytetrafluoretylen, eller PTFE, rør, med en gummipropp i den ene enden. Forsegle den andre enden av røret med en annen propp og blits fryse prøven i flytende nitrogen. Fjern deretter stopperne raskt og legg PTFE-slangen i et merket kryorør for flytende nitrogenlagring.For EPR-målinger fyller du fingerdewar av EPR-spektrometeret med flytende nitrogen og plasserer PTFE-slangen som inneholder prøven i det flytende nitrogenet. Plasser fingeren dewar i EPR spektrometeret og sett EPR oppkjøpsparametere for målinger på 77 grader Kelvin. For ROS-deteksjon i frosset lungevev, legg vevet på tørris og bruk pinsett for å stabilisere det flashfrosne vevet på tørris.Skjær prøven i fem 15 mg stykker, og veie bitene i en tjære 1,5 milliliter rør. Tilsett 196 mikroliter KHB pluss DTPA og fire mikroliter CMH i prøven, og inkuber lungeprøven i en time i et 37 graders Celsius vannbad før du pelleting vevfragmentene med en kort sentrifugering. Plasser deretter prøven på is før du overfører 150 mikroliter av supernatanten til et stykke PTFE-slange for blitsfrysing i utarbeidelsen av EPR-måling som nettopp demonstrert.Evaluering av den totale superoksidproduksjonen i rå 264,7 celler stimulert med PMA som demonstrert, viser at nitroksidkonsentrasjonen i både cellesuspensjonen og bufferen til DE PMA-behandlede cellene er lik, på grunn av gjennomtrengelig natur og rask likevekt av spinnproben. Nitroxideradikaler signalet øker i rå 264,7 celler stimulert med PMA, sammenlignet med kontrollceller, men ikke i celler forbehandlet med celle-ugjennomtrengelig superoksid dismutase. Konsentrasjonen av nitroksid oppnådd ved lave temperaturer i rå 264,7 celler etter stimulering med PMA er også redusert i nærvær av superoksiddismutase i samsvar med romtemperaturdataene.Nitroksidkonsentrasjonen økes i blod- og bronkoalveollærskyllingsvæsken av bleomus og behandlede mus, så vel som i supernativa av høstede lungevevsbiter fra bleomus og skadede dyr, sammenlignet med PBS-behandlede kontroller. Videre, etter retro-orbital spin probe injeksjon, viser bleomus og behandlede dyr et høyere spinnsondesignal sammenlignet med kontroller. Disse praktiske protokollene vil tillate forskere å teste fri radikal produksjon i forskjellige cellulære rom og biologiske prøver av EPR, inkludert lave temperaturmålinger.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: En metode for å fange og løse protein komplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse av β-Amyloid-indusert unormalt Fibrin Clot struktur av spektroskopi og skanning elektronmikroskop

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjerning og utskifting av endogene ligander fra Lipidbundne proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokrystallelektrondiffraksjon av små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...