Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
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Este trabalho foi financiado pela escola de medicina do reitor award de infra-estrutura de pesquisa estratégica, R01 HL086680-09 e 1R35HL139726-01, a E.N.G. e UCD CFReT prêmio de fellowship (ele) Universidade do Colorado. Os autores graças a Dr. Sandra Eaton e Dr. Gareth Eaton (Universidade de Denver), Dr. Gerald Rosen e Dr. Joseph P. Kao (Universidade de Maryland) e Dr. Sujatha Venkataraman (Universidade de Colorado Denver) para discussões úteis e Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie e Ivy McDermott (Universidade de Colorado Denver) para suporte técnico.

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Colorado Denver institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização.
1. preparação dos reagentes
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic estoque de ácido (DTPA) (150 mM)
	<ol>
<li>Adicionar 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL de água desionizada.</li>
		<li>Para dissolver DTPA, adicionar 1 M de NaOH, gota a gota e levar a um pH de 7,0.</li>
		<li>Trazer o volume para 50 mL com água para uma concentra...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

A avaliação da produção de radicais livres em configurações biológicas é importante em redox de compreensão regulamentada a sinalização na saúde e na doença, mas a medida destas espécies é altamente desafiadora devido a meia-vida curta de espécies radicalares e técnica limitações com métodos comumente usados. EPR é uma ferramenta poderosa e valiosa em biologia redox, como é o método somente inequívoco para a detecção de radicais livres. Neste projeto, demonstramos métodos práticos de EPR para ...

Enquanto medidas de estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio são importantes para o estudo de diversas doenças em todos os sistemas do órgão, a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um desafio devido a uma meia-vida curta e alta reatividade. Uma técnica de ressonância paramagnética (EPR) do elétron é o método mais inequívoco para a detecção de radicais livres. Sondas de rotação têm vantagens sobre as sondas fluorescentes mais comumente usadas. Apesar de sondas fluorescentes são relativamente baratos e fáceis de usar e fornecer detecção rápida e sensível de ROS, têm sérias limitações devido a sinais diferente, a incapacidade de se calcular as concentrações de ROS e uma falta geral de especificidade1 .
Para facilitar o uso de EPR para estudos biológicos, uma variedade de spin sondas foram sintetizadas que pode medir uma gama de espécies radicalares biologicamente relevantes, bem como pO2, pH e redox afirma2,3, 4,5,6,7. Armadilhas de rotação também foram desenvolvidas para capturar radicais de curta duração e vida longa forma adutos, que proporciona a detecção por EPR8. Ambas as classes (sondas de girar e girar armadilhas) têm vantagens e limitações. Uma classe comumente usado de sondas de rotação são hidroxilaminas cíclicas, que são o EPR-silencioso e reagem com os radicais de curta duração para formar um nitroxide estável. Hidroxilaminas cíclicas reagem com superóxido 100 vezes mais rápido do que as armadilhas de rotação, permitindo-lhes competir com antioxidantes celulares, mas eles carecem de especificidade e requerem o uso de controles apropriados e inibidores para identificar a espécie radical ou fonte responsável pelo sinal nitroxide. Enquanto a rotação armadilhas especificidade de exposição, com distintas espectral de que padrões, dependendo da espécie presa, eles têm cinética lenta para superóxido spin trapping e são propenso a biodegradação do radical adutos. Pedidos de interceptação de rotação foram bem documentados em investigação biomédica9,10,11,12,13.
O objetivo deste projeto é demonstrar métodos práticos de EPR para projetar experiências e preparação de amostras para detectar superóxido, usando a rotação sondas em diferentes compartimentos celulares in vitro e em tecidos diferentes compartimentos na vivo. Diversos manuscritos publicaram protocolos relevantes para esses objetivos, utilizando sondas de rotação alvo permeável ao celular, celular-impermeáveis e mitocondrial ao tecido alvo diferentes compartimentos celulares in vitro e processo para análise em modelos do rato 14 , 15. vamos construir sobre este corpo de literatura, Validando uma abordagem para medir superóxido usando uma sonda de rotação (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine em diferentes compartimentos celulares em vitro para garantir precisão medições, destacando possíveis problemas técnicos que podem distorcer os resultados. Nós também fornecemos métodos para realizar medições de EPR em sangue, líquido de lavagem broncoalveolar e tecido pulmonar usando a sonda de rotação CMH. Estes estudos podem comparar diferentes métodos para processar os tecidos, bem como apresentar um método para injetar outra sonda de rotação, CPH, em ratos antes da colheita de tecidos. Finalmente, nós desenvolvemos um método prático para armazenar as amostras em tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir o armazenamento e transferência de amostras antes de medições de EPR em 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

A detecção precisa e específica de espécies reativas de oxigênio (ROS) em diferentes compartimentos celulares e tecidos é essencial para o estudo de redox-regulado sinalização nas configurações biológicas. Espectroscopia de ressonância paramagnética de electrões (EPR) é o método direto apenas para avaliar os radicais livres de forma inequívoca. Sua vantagem é que ele detecta níveis fisiológicos das espécies específicas com uma elevada especificidade, mas requer tecnologia especializada, preparação cuidadosa da amostra e controlos adequados para garantir a exata interpretação dos dados. Sondas de rotação cíclica de hidroxilamina reagem seletivamente com superóxido ou outros radicais para gerar um sinal de nitroxide que pode ser quantificado por espectroscopia de EPR. Sondas de rotação célula-permeável e sondas de rotação projetadas para acumular rapidamente nas mitocôndrias permitem a determinação da concentração de superóxido em diferentes compartimentos celulares.
Em culturas de células, o uso de célula permeável 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) junto com e sem pré-tratamento de célula-impermeável superóxido dismutase (SOD) ou uso de célula-permeável PEG-SOD, permite a diferenciação de extracelular de superóxido citosólico. O 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidínico dicloreto (mito-ritmo-H) permite a medição de ROS mitocondrial (predominantemente superóxido).
Sondas de rotação e espectroscopia EPR também podem ser aplicados aos modelos na vivo . Superóxido pode ser detectado em líquidos extracelulares como o sangue e fluido alveolar, bem como os tecidos como o tecido pulmonar. Vários métodos são apresentados para processar e armazenar tecido para medições de EPR e entregar intravenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotação sonda em vivo. Enquanto as medições podem ser executadas em temperatura ambiente, as amostras obtidas de modelos in vitro e in vivo também podem ser armazenadas a-80 ° C e analisadas pelo EPR em 77 K. As amostras podem ser armazenadas no estábulo de tubos especializados a-80 ° C e executadas em 77 K para habilitar um prático, eficiente e o método reprodutível que facilita o armazenamento e transferência de amostras.

Deteção de superóxido usando CMH foi validada usando o X / geração de superóxido XO sistema para demonstrar que o sinal nitroxide (CM.) foi totalmente inibido pela SOD, enquanto catalase não teve nenhum efeito (figura 1A). O superóxido total, extracelular então foi avaliado em 264.7 pilhas por pilhas de incubação com a sonda de rotação CMH célula-permeável + /-pré-tratamento da SOD. A concentração de nitroxide foi medida na suspen...

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Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

A sinalização de redox disregulada está implicada na patogênese de diversas doenças. O estudo da biologia redox requer a detecção precisa de espécies reativas de oxigênio em diferentes compartimentos celulares e tecidos. A espectroscopia de EPR é o único método que mede os radicais livres de forma inequívoca.Este protocolo demonstra um método prático de manuseio e armazenamento de amostras biológicas para espectroscopia de EPR. Estes protocolos ilustram o uso de sondas EPR e spin em dois modelos representativos. Embora possam ser adaptados para avaliar as espécies ativas em outros ambientes biológicos.O desenho do experimento e o manuseio da amostra são fundamentais para sua reprodutibilidade. Recomendamos considerar a densidade celular e garantir controles adequados para o tempo. Comece lavando suavemente células cruas 264,7 com um mililitro de Krebs-Henseleit Buffer ou KHB, por bem.E trate as células com 500 microliters de KHB, suplementadas com 100 micromil de DTPA por poço. Para pré-tratamento com dismutase de superóxido, adicione 15 microliters de material de desmutase de superóxido, ou veículo, a cada poço, e coloque a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. No final do pré-tratamento de dismutase de superóxido, adicione 12,5 microliters de 10 mililitros CMH e 40 microliters de 125 micromolares pma solução de trabalho para os poços apropriados, e incubar a 37 graus Celsius por 50 minutos.Coloque imediatamente as placas no gelo e colete o tampão de cada poço em tubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 100 microliters de KHB fresco mais DTPA a cada poço e raspe suavemente as células da parte inferior de cada poço. Em seguida, resuspenco as suspensões celulares com tubulação e transfira as células para tubos individuais de 1,5 mililitro no gelo.Para detecção de superóxido à temperatura ambiente, primeiro carregue 50 microlitadores de um tampão ou amostra celular em um tubo capilar e selado o tubo. Coloque imediatamente o tubo na ressonância paramagnética eletrônica, ou EPR, espectrômetro e defina os parâmetros de aquisição de EPR para medições de temperatura ambiente. Teste sempre uma amostra em branco de tampão contendo a mesma concentração de sonda tratada sob as mesmas condições experimentais de um controle.Para detecção de superóxido a 77 graus Kelvin, carregue 150 microliters de uma amostra em um pedaço de politetrafluoroetileno reto, ou PTFE, tubo, com uma rolha de borracha em uma extremidade. Sele a outra extremidade do tubo com uma segunda rolha e o flash congele a amostra em nitrogênio líquido. Em seguida, remova rapidamente as rolhas e coloque a tubulação PTFE em um crioboto rotulado para armazenamento de nitrogênio líquido.Para medições de EPR, encha a de guerra do espectrômetro EPR com nitrogênio líquido e coloque a tubulação PTFE contendo a amostra no nitrogênio líquido. Coloque o dedo deguerr o espectrômetro EPR e ajuste os parâmetros de aquisição do EPR para medições a 77 graus Kelvin. Para detecção de ROS em tecido pulmonar congelado, coloque o tecido em gelo seco e use pinças para estabilizar o tecido congelado em gelo seco.Corte a amostra em cinco pedaços de 15 miligramas, e pese os pedaços em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 196 microliters de KHB mais DTPA e quatro microliters de CMH à amostra, e incubar a amostra pulmonar por uma hora em um banho de água de 37 graus Celsius antes de pelleting os fragmentos de tecido com uma breve centrifugação. Em seguida, coloque a amostra no gelo antes de transferir 150 microlitadores do supernante em um pedaço de tubo PTFE para congelamento de flash na preparação da medição de EPR como apenas demonstrado.A avaliação da produção total de superóxido em células brutas 264,7 estimuladas com PMA como demonstrado, revela que a concentração de nitroxídeo tanto na suspensão celular quanto no tampão das células tratadas com PMA é semelhante, devido à natureza permeável e ao rápido equilíbrio da sonda spin. O sinal de radical nitroxide aumenta em células brutas 264,7 estimuladas com PMA, em comparação com células de controle, mas não em células pré-tratadas com desmutase de superóxido impermeável por células. A concentração de nitroxídio obtida a baixas temperaturas em células brutas de 264,7 após a estimulação com PMA também é atenuada na presença de dismutase de superóxido consistente com os dados de temperatura ambiente.A concentração de nitroxídeo é aumentada no sangue e no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos bleo e camundongos tratados, bem como dentro dos supernaciantes de pedaços de tecido pulmonar colhido de camundongos bleo e animais feridos, em comparação com os controles tratados com PBS. Além disso, após a injeção de sonda de spin retro-orbital, camundongos bleo e animais tratados demonstram um sinal de sonda de giro mais alto em comparação com os controles. Esses protocolos práticos permitirão que os pesquisadores testem a produção radical livre em diferentes compartimentos celulares e amostras biológicas por EPR, incluindo medições de baixa temperatura.

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