Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Эта работа была поддержана университета Колорадо школы медицины Дин стратегической инфраструктуры исследований премии, R01 HL086680-09 и 1R35HL139726-01, E.N.G. и UCD CFReT стипендия, (он). Авторы благодарят д-р Сандра Eaton и доктор Гарет Eaton (Денверский университет), д-р Джеральд Розен и д-р Джозеф P. Као (Университет штата Мэриленд) и доктор Суджатха Венкатараман (Университет штата Колорадо Денвер) для полезной дискуссии и Джоан Maltzahn, Эшли Trumpie и Ivy Макдермотт (Университет штата Колорадо Денвер) для технической поддержки.

Все исследования на животных были утверждены в университете Колорадо Денвер институциональных животное уход и использование Комитета.
1. Подготовка реагентов
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic кислота (DTPA) фондовой (150 мм)
	<ol>
<li>Добавить 2,95 g DTPA (393.35 г/моль) до 10 мл обессоленно?...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Оценка производство свободных радикалов в биологических параметров имеет важное значение в понимании редокс регулируется сигнализации в здоровье и болезни, но мера этих видов является очень сложным из-за короткий период полураспада видов свободных радикалов и технического ограниче?...

Меры оксидативного стресса и реактивнооксигенных видов имеют важное значение для изучения различных заболеваний во всех органов и систем, обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) является сложной задачей из-за короткий период полураспада и высокую реакционную способность. Электронного парамагнитного резонанса (EPR) техника является самым недвусмысленным метод для обнаружения свободных радикалов. Спин зонды имеют преимущества над более часто используемых флуоресцентных зондов. Хотя флуоресцентных зондов, относительно недорогой и простой в использовании и обеспечивают быстрый, чувствительность обнаружения ROS, они имеют серьезные ограничения, обусловленные артефакты сигналов, неспособность рассчитать концентрации рос и общее отсутствие конкретности1 .
Для облегчения использования ОРЭД для биологических исследований, различные датчики были синтезированы спина, что можно измерить широкий спектр видов биологически соответствующих свободных радикалов, а также ро2, pH и редокс государств2,3, 45,,6,7. Также были разработаны спин ловушки для захвата недолго радикалов и формы долгоживущие аддукты, который облегчает обнаружение по ОРЭД8. Оба класса (спин зондов и спин ловушки) имеют свои преимущества и ограничения. Один из часто используемых класс спин зонды являются циклических Гидроксиламины, которые НРА молчаливый и реагировать с недолгим радикалы для формирования стабильной nitroxide. Циклические Гидроксиламины реагируют с супероксид 100 раз быстрее, чем спин ловушки, что позволяет им конкурировать с сотовой антиоксидантов, но они неконкретны и требуют использования надлежащего контроля и ингибиторов для идентификации радикальной видов или источник ответственный за nitroxide сигнала. В то время как спина ловушки экспонат специфичности, с различных спектральных шаблонов в зависимости от захваченных видов, они имеют медленно кинетики супероксид спина треппинга и подвержен биодеградации радикала аддукты. Приложений для треппинга спин были хорошо документированы в биомедицинских исследований9,10,11,12,13.
Целью этого проекта является демонстрация практических методов ОРЭД для проектирования экспериментов и подготовка образцов для обнаружения супероксида с помощью спин зонды в различных клеточных отсеков в пробирке и в различные ткани отсеков в естественных условиях. Несколько рукописей были опубликованы протоколы соответствующих для этих целей, с использованием клеток проницаемой, клетки непроницаемый и митохондриальной целевых спин зонды для различных клеточных отсеков в пробирке и процесс ткани-мишени для анализа в модели мыши 14 , 15. Мы строим на этот орган литературы, проверяя подход к супероксиддисмутаза, используя 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine зонд спин (CMH) в различных клеточных отсеков в пробирке для обеспечения точного измерения измерения, подчеркнув потенциальные технические проблемы, которые могут исказить результаты. Мы также предоставляют методы для выполнения измерений ОРЭД в крови, Бронхоальвеолярный лаваж жидкости и легочной ткани с помощью зонда спин КМЗ. Эти исследования сравнить разные методы для обработки тканей, а также метод придать еще один спин зонд, CPH, мышей до уборки ткани. Наконец мы разрабатываем практический метод для хранения образцов труб из политетрафторэтилена (ПТФЭ) для хранения и передачи образцов до измерения ОРЭД в 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Точным и конкретным обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) в разных отсеках, клеточные и тканевые имеет важное значение для изучения редокс регулируемых сигнализации в биологических параметров. Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является единственным прямым методом однозначно оценить свободных радикалов. Его преимущество заключается в том, что он обнаруживает физиологических уровнях конкретных видов с высокой точностью, но он требует специализированной технологии, тщательно пробоподготовки и соответствующие элементы управления для обеспечения точной интерпретации данных. Циклические гидроксиламина спин зонды избирательно реагируют с супероксид или другие радикалы для генерации сигнала nitroxide, которые могут быть количественно методом ЭПР спектроскопии. Ячейки проницаемой спин зонды и спин датчики предназначены для накопления быстро в митохондриях позволяют для определения концентрации супероксид в различных клеточных отсеках.
В культивируемых клеток, использование клеток проницаемых 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) наряду с и без предварительной обработки клеток непроницаемый супероксид дисмутаза (SOD) или использование клеток проницаемой PEG-SOD, позволяет дифференциация внеклеточного от цитозольной супероксида. Митохондриальной 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium дихлорид (mito темп-H) позволяет для измерения митохондриальной Рось (преимущественно супероксиддисмутаза).
ЭПР спектроскопии и спин зонды также может применяться к моделям в естественных условиях . Супероксид могут быть обнаружены в внеклеточной жидкости, крови и альвеолярной жидкости, а также ткани, такие как легочной ткани. Несколько методов представлены для обработки и хранения тканей для измерений ОРЭД и доставки внутривенных 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) спина зонд в естественных условиях. Во время измерения могут быть выполнены при комнатной температуре, образцы, полученные in vitro и in vivo модели также могут быть хранятся при температуре-80 ° C и проанализированы по ОРЭД в 77 K. Образцы можно хранить в специализированных трубы стабильной температуре-80 ° C и работать на 77 K чтобы практическая, эффективную и воспроизводимый метод, который облегчает хранение и передача образцов.

Супероксид обнаружения с помощью КМЗ была проверена с помощью X / XO супероксид генерации системы, позволяющие продемонстрировать, что сигнал nitroxide (см..) полностью тормозится SOD, в то время как каталазы имел никакого эффекта (рис. 1A). Всего, внеклеточ?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является недвусмысленным метод измерения свободных радикалов. Использование селективного спин зондов позволяет для обнаружения свободных радикалов в различных клеточных отсеках. Мы представляем практический и эффективный метод для сбора биологических проб, которые облегчают обработки, хранения и передачи образцы для измерения ОРЭД.

Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Дисрегулируемая красная сигнализация вовлечена в патогенез различных заболеваний. Изучение биологии редокса требует точного обнаружения реактивных видов кислорода в различных клеточных и тканевых отсеках. Спектроскопия EPR является единственным методом, который измеряет свободные радикалы однозначно.Этот протокол демонстрирует практический метод обработки и хранения биологических образцов для спектроскопии ЭПР. Эти протоколы иллюстрируют использование EPR и спин-зондов в двух репрезентативных моделях. Хотя они могут быть адаптированы для оценки активных видов в других биологических условиях.Конструкция эксперимента и обработка образца имеют решающее значение для его воспроизводимости. Мы рекомендуем учитывать плотность клеток и обеспечивать надлежащие элементы управления, соответствующие времени. Начните с мягкого мытья сырых 264,7 клеток с одним миллилитров Кребс-Хенселейт буфер или KHB, на колодец.И лечить клетки с 500 микролитров KHB, дополненный 100 микромил DTPA на колодец. Чтобы предварительно обработать супероксиддисмутазой, добавьте 15 микролитров бульона супероксиддисмутазы, или транспортного средства, к каждой хорошо, и поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. В конце предварительной обработки супероксиддисмутазы добавьте 12,5 микролитров 10 миллимоляров CMH и 40 микролитров 125 микромоляров PMA рабочего раствора к соответствующим скважинам и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут.Немедленно поместите пластины на лед и соберите буфер из каждого колодец в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду. Затем добавьте 100 микролитров свежего KHB плюс DTPA к каждому колодец и аккуратно соскреблите клетки со дна каждой хорошо. Затем повторное использование клеточных суспензий с пипетками и передача клеток в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду.Для обнаружения супероксида при комнатной температуре сначала загрузите 50 микролитров одного буфера или образца клетки в капиллярную трубку и запечатайте трубку. Немедленно поместите трубку в электронный парамагнитный резонанс, или спектрометр EPR, и установите параметры приобретения EPR для измерения комнатной температуры. Всегда проверьте пустой образец буфера, содержащий ту же концентрацию зонда, обработанного в тех же экспериментальных условиях, что и контроль.Для обнаружения супероксида при 77 градусах Кельвина загрузите 150 микролитров одного образца в кусок прямого полиэтилена размером от одного до двух дюймов, или PTFE, трубки, с резиновой пробкой на одном конце. Печать другой конец трубки со второй пробкой и вспышки заморозить образец в жидком азоте. Затем быстро удалите пробки и поместите трубки PTFE в помеченную криотрубку для хранения жидкого азота.Для измерений ЭПР заполните двойку пальца спектрометра EPR жидким азотом и поместите трубки PTFE, содержащие образец в жидком азоте. Поместите двойку пальца в спектрометр EPR и установите параметры приобретения EPR для измерений на 77 градусов Кельвина. Для обнаружения ROS в замороженных тканях легких поместите ткань на сухой лед и используйте пинцет для стабилизации флэш-замороженной ткани на сухом льду.Разрежьте образец на пять 15 миллиграммов кусочки и взвесьте кусочки в смоляной трубке весом 1,5 миллилитров. Добавьте 196 микролитров KHB плюс DTPA и четыре микролитера CMH в образец, и инкубировать образец легких в течение одного часа в 37 градусов по Цельсию водяной бане, прежде чем гранулировать фрагменты ткани с краткой центрифугации. Затем поместите образец на лед перед передачей 150 микролитров супернатанта в кусок трубки PTFE для флэш-замораживания при подготовке измерения EPR, как только что продемонстрировано.Оценка общего производства супероксида в необработанных 264,7 клеток, стимулируемых ПМА, как было продемонстрировано, показывает, что концентрация нитроксида как в клеточной суспензии, так и в буфере обработанных ПМА клеток аналогична, благодаря проницаемому характеру и быстрой эквилибрации спинового зонда. Нитроксидные радикалы сигнал увеличивается в сырых 264,7 клеток стимулируется с ПМА, по сравнению с контрольными клетками, но не в клетках, предварительно обработанных клеточной непроницаемой супероксид дисмутазы. Концентрация нитроксида, полученного при низких температурах в сырых 264,7 клетках после стимуляции с помощью ПМА, также затухается при наличии дисмутазы супероксида в соответствии с данными комнатной температуры.Концентрация нитроксида увеличивается в крови и бронхоальвеолярной жидкости лаважа мышей блео и обработанных мышей, а также в супернатантах собранных частей легочной ткани от мышей блео и раненых животных, по сравнению с обработанными PBS контролем. Кроме того, после инъекции ретро-орбитального спина зонда, bleo мышей и обработанных животных демонстрируют более высокий сигнал зонд спина по сравнению с управления. Эти практические протоколы позволят исследователям протестировать свободное радикальное производство в различных клеточных отсеках и биологические образцы ЭПР, включая измерения низкой температуры.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

подготовки и<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование тестовое активность на основе для<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Кислота амидазные

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...