Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Detta arbete stöds av University of Colorado skola av medicin rektorns strategiska forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 och 1R35HL139726-01, till E.N.G. och UCD CFReT fellowship award (han). Författarna tackar Dr. Sandra Eaton och Dr Gareth Eaton (University of Denver), Dr Gerald Rosen och Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), och Dr Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) för bra diskussioner och Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie och Ivy McDermott (University of Colorado Denver) för teknisk support.

Alla djurstudier godkändes av University of Colorado Denver institutionella djur vård och användning kommittén.
1. beredning av reagens
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic syra (DTPA) lager (150 mM)
	<ol>
<li>Tillsätt 2,95 g DTPA (393.35 g/mol) till 10 mL avjoniserat vatten.</li>
		<li>För att upplösa DTPA, tillsätt 1 M NaOH droppvis och ett pH på 7,0.</li>
		<li>Ta volymen till 50 mL med vatten för DTPA koncentration på 150 mM och lagra vid 4 ° C.</li>
	</ol>...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Bedömningen av produktionen av fria radikaler i biologiska inställningar är viktigt i förståelse redox reglerade signalering vid hälsa och sjukdom, men åtgärden av dessa arter är mycket utmanande på grund av den korta halveringstiden av fria radikaler arter och tekniska begränsningar med vanliga metoder. EPR är ett värdefullt och kraftfullt verktyg i redox biologi, eftersom det är den enda entydig metoden för att upptäcka fria radikaler. I det här projektet visar vi praktiska EPR metoder för att utforma...

Medan åtgärder av oxidativ stress och reaktiva syreradikaler är viktiga att studera olika sjukdomar över alla organsystem, är detektion av reaktiva syreradikaler (ROS) utmanande på grund av en kort halveringstid och höga reaktivitet. En elektron paramagnetiska resonans (EPR) teknik är mest otvetydiga metoden för att påvisa fria radikaler. Spin sonder har fördelar jämfört med vanliga fluorescerande sonderna. Även fluorescerande sonder är relativt billig och lätt att använda och ger snabb och känslig detektion av ROS, har de allvarliga begränsningar på grund av artefaktiska signaler, en oförmåga att beräkna ROS koncentrationer, och en allmän brist på specificitet1 .
För att underlätta användningen av EPR för biologiska studier, en mängd spin sonder har syntetiserats som kan mäta en rad biologiskt relevanta fri radikal arter samt pO2, pH och redox påstår2,3, 4,5,6,7. Spin fällor har också utvecklats för att fånga kortlivade radikaler och form long-levande addukter, vilket underlättar upptäckt av EPR8. Båda klasserna (spin sonder och spin fällor) har fördelar och begränsningar. Ett vanligt förekommande aktieslag spin sonder är cykliska hydroxylamines, som är EPR-tyst och reagera med kortlivade radikaler att bilda en stabil nitroxide. Cyklisk hydroxylamines reagerar med superoxid 100 gånger snabbare än spin fällor, gör det möjligt för dem att konkurrera med cellulära antioxidanter, men de saknar specificitet och kräver användning av lämpliga kontroller och hämmare att identifiera den radikala arter eller källan ansvarig för nitroxide signalen. Medan spin fällor utställning specificitet, med distinkta spektrala mönster beroende på de fångade arterna, de har långsam kinetik för superoxid snurra svällning och är benägna att biologisk nedbrytning av radikalen addukter. Ansökningar om spin svällning har varit väldokumenterade i biomedicinsk forskning9,10,11,12,13.
Målet med detta projekt är att demonstrera praktiska EPR metoder för att utforma experiment och förbereda prover att upptäcka superoxid använder spin sonder i olika cellulära fack in vitro och i olika vävnader fack in-vivo. Flera manuskript har publicerat protokoll som är relevant för dessa mål, med hjälp av cell-permeable, cell-impermeable och mitokondrie riktade spin sonder till olika cellulära fack in vitro- och process målvävnaden för analys i musmodeller 14 , 15. vi bygga på denna mängd litteratur genom att verifiera en metod för att mäta superoxid med en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sond i olika cellulära fack in vitro- för att säkerställa korrekt mätningar, belysa eventuella tekniska problem som kan förvränga resultaten. Vi erbjuder även metoder för att utföra EPR mätningar i blodet, bronkoalveolär lavage vätska och lungvävnad använder CMH spin sonden. Dessa studier jämför olika metoder för att bearbeta vävnader samt presentera en metod för att injicera en annan spin probe, CPH, i möss före skörd vävnad. Slutligen, vi utveckla en praktisk metod för att lagra prover i polytetrafluoreten (PTFE) slangar för lagring och överföring av prover innan EPR mätningar vid 77 K.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Den korrekta och specifikt påvisande av reaktiva syreradikaler (ROS) i olika cellulära och vävnad fack är avgörande för studien av redox-reglerade signalering i biologiska inställningar. Paramagnetiska resonans elektronspektroskopi (EPR) är den enda direkta metoden att bedöma fria radikaler otvetydigt. Dess fördel är att det identifierar fysiologiska nivåer av specifika arter med en hög specificitet, men det kräver specialiserad teknik, försiktig provberedning och lämpliga kontroller för att säkerställa korrekt tolkning av data. Cyklisk hydroxylamin spin sonder reagerar selektivt med superoxid eller andra radikaler för att generera en nitroxide signal som kan kvantifieras av EPR-spektroskopi. Cell-permeable spin sonder och spin sonder utformad ansamlas snabbt i mitokondrierna möjliggör bestämning av superoxid koncentration i olika cellulära fack.
I odlade celler, användning av cell genomsläppliga 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) längs med och utan cell-impermeable superoxid dismutase (SOD) förbehandling eller användning av cell-permeable PEG-SOD, möjliggör den differentiering av extracellulära från cytosoliska superoxid. Den mitokondriella 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium-diklorid (mito-TEMPO-H) möjliggör mätning av mitokondriell ROS (främst superoxid).
Spin sonder och EPR-spektroskopi kan också tillämpas i vivo modeller. Superoxid kan upptäckas i extracellulära vätskan som blod och alveolär vätska, liksom vävnader såsom lungvävnad. Flera metoder presenteras för att bearbeta och lagra vävnad för EPR mätningar och leverera intravenös 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonden i vivo. Medan mätningar kan utföras vid rumstemperatur, kan prover som erhållits från in vitro- och in-vivo modeller också lagras vid-80 ° C och analyseras av EPR på 77 K. Proverna kan lagras i specialiserade slangar stabil vid-80 ° C och kör på 77 K för att aktivera en praktisk, effektiv, och reproducerbar metod som underlättar lagring och överföra prover.

Superoxid detektering med CMH validerades med X / XO superoxid genererar systemet att visa att nitroxide (.CM) signalen hämmades fullt av SOD, medan katalas hade ingen effekt (figur 1A). Den totala, extracellulär superoxid utvärderades sedan hos RAW 264,7 celler av ruvande celler med cell-permeable CMH spin sonden +/-SOD förbehandling. Nitroxide koncentrationen mättes både cellsuspension och bufferten, vilket visade att värdena i de två typ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektronspektroskopi paramagnetiska resonans (EPR) är en entydig metod för att mäta fria radikaler. Användningen av selektiva spin sonder möjliggör detektering av fria radikaler i olika cellulära fack. Vi presenterar en praktisk och effektiv metod för att samla in biologiska prov som underlättar att behandla, lagra och överföra prover för EPR mätningar.

Användning av elektron paramagnetiska resonans i biologiska prover vid omgivningstemperatur och 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Dysregulated redox signalering är inblandad i patogenesen vid olika sjukdomar. Studien av redoxbiologi kräver korrekt detektering av reaktiva syrearter i olika cell- och vävnadsfack. EPR-spektroskopi är den enda metod som mäter fria radikaler entydigt.Detta protokoll visar en praktisk metod för hantering och lagring av biologiska prover för EPR spektroskopi. Dessa protokoll illustrerar användningen av EPR och spinnsonder i två representativa modeller. Även om de kan anpassas för att utvärdera den aktiva arten i andra biologiska miljöer.Experimentets utformning och hanteringen av provet är kritiska för dess reproducerbarhet. Vi rekommenderar att överväga celltäthet och säkerställa lämpliga tidsmatchade kontroller. Börja med att försiktigt tvätta råa 264,7 celler med en milliliter av Krebs-Henseleit Buffer eller KHB, per brunn.Och behandla cellerna med 500 mikroliter av KHB, kompletterat med 100 mikromil DTPA per brunn. För att förförhand med superoxiddismutas, tillsätt 15 mikroliter av superoxiddismutaslager, eller fordon, till varje brunn, och placera plattan vid 37 grader Celsius i 10 minuter. I slutet av förbehandlingen med superoxiddismutas, tillsätt 12,5 mikroliter på 10 millimolar CMH och 40 mikroliter av 125 mikromolära PMA-arbetslösning till lämpliga brunnar och inkubera vid 37 grader Celsius i 50 minuter.Placera omedelbart plattorna på is och samla in bufferten från varje brunn in i enskilda 1,5 milliliter rör på is. Därefter lägger du till 100 mikroliter av färsk KHB plus DTPA till varje brunn och skrapar försiktigt cellerna från botten av varje brunn. Sedan resuspend cell suspensioner med pipettering och överföra cellerna i enskilda 1,5 milliliter rör på is.För superoxiddetektering vid rumstemperatur, första belastningen 50 mikroliter av en buffert eller cellprov i ett kapillärrör och försegla röret. Placera omedelbart röret i elektronparamagnetisk resonans, eller EPR, spektrometer och ställ in EPR-anskaffningsparametrarna för rumstemperaturmätningar. Testa alltid ett blankprov av buffert som innehåller samma koncentration av sond som behandlats under samma experimentella förhållanden som en kontroll.För superoxiddetektering vid 77 grader Kelvin, ladda 150 mikroliter av ett prov i en en till två tum bit rak polytetrafluoreten, eller PTFE, slangar, med en gummipropp i ena änden. Täta den andra änden av röret med en andra propp och flash frysa provet i flytande kväve. Ta sedan snabbt bort propparna och placera PTFE-slangen i en märkt kryorör för lagring av flytande kväve.För EPR-mätningar fyll EPR-spektrometerns fingerdev med flytande kväve och placera rörrören för PTFE som innehåller provet i det flytande kvävet. Placera fingerdevarm i EPR-spektrometern och ställ in EPR-anskaffningsparametrarna för mätningar på 77 grader Kelvin. För ROS-detektion i frusen lungvävnad, placera vävnaden på torris och använd pincett för att stabilisera den flashfrusna vävnaden på torris.Skär provet i fem 15 milligram bitar, och väg bitarna i en tared 1,5 milliliter rör. Tillsätt 196 mikroliter av KHB plus DTPA och fyra mikroliter av CMH till provet, och inkubera lungprovet i en timme i ett 37 graders Celsius vattenbad innan vävnadsfragmenten pelleeras med en kort centrifugering. Placera sedan provet på is innan du överför 150 mikroliter av supernatanten i en bit PTFE-slangar för blixtfrysning vid beredning av EPR-mätning som just visats.Utvärdering av den totala superoxidproduktionen i råa 264,7-celler som stimuleras med PMA som påvisas, avslöjar att nitroxidkoncentrationen i både cellupphängningen och bufferten för de PMA-behandlade cellerna är likartad, på grund av spinnsondens genomsläppliga natur och snabba jämvikt. Nitroxidradikaalerna signal ökar i rå 264,7 celler stimuleras med PMA, jämfört med kontrollceller, men inte i celler som behandlats med cell-ogenomtränglig superoxiddismutas. Koncentrationen av nitroxid som erhålls vid låga temperaturer i råa 264,7 celler efter stimulering med PMA dämpas också i närvaro av superoxiddismutas som överensstämmer med rumstemperaturdatan.Nitroxidkoncentrationen ökas i blodet och bronchoalveolar lavagevätska hos bleo möss och behandlade möss, samt inom supernatanterna av skördade lungvävnadsbitar från bleo möss och skadade djur, jämfört med PBS-behandlade kontroller. Vidare, efter retro-orbital spin sond injektion, bleo möss och behandlade djur visar en högre spin probe signal jämfört med kontroller. Dessa praktiska protokoll kommer att göra det möjligt för forskare att testa fri radikal produktion i olika cellulära fack och biologiska prover av EPR, inklusive lågtemperaturmätningar.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillärelektrofores-masspektrometri för Metabolic Profiling av biologiska prover

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

förberedelse och<em&gt; In Vivo</em&gt; Användning av en aktivitetsbaserad Probe för<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidas

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Ett förfarande för infångning och Lösa proteinkomplex i biologiska prover

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokristallelektrondiffraktion av små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...