Name: use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Bu eser tıp Dekan'ın Stratejik Araştırma altyapı Ödülü, R01 HL086680-09 ve 1R35HL139726-01, E.N.G. ve UCD CFReT Dostluk Ödülü (o) Colorado Üniversitesi Okulu tarafından desteklenmiştir. Dr Sandra Eaton ve Dr. Gareth Eaton (Denver Üniversitesi), Dr. Gerald Rosen ve Dr. Joseph P. Kao (İstanbul Üniversitesi) ve Dr Sujatha Venkataraman (Colorado Üniversitesi, Denver) için yararlı tartışmalar ve Joanne Maltzahn, Ashley yazarlar teşekkür Trumpie ve teknik destek için Ivy McDermott (Colorado Üniversitesi, Denver).

Tüm hayvan çalışmaları University of Colorado Denver kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>
Diethylenetriaminepentaacetic asit (DTPA) hisse senedi (150 mM)
	<ol>
<li>DTPA 2.95 g ekleyin (393.35 g/mol) 10 mL deiyonize su için.</li>
		<li>DTPA çözülmeye, 1 M NaOH dropwise ekleyin ve 7.0 bir pH getirmek.</li>
		<li>50 mL su için 150 mM son DTPA konsantrasyon ile ses getirmek ve 4 ° C'de depolayın<...

<ol>
	<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li><li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals.">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li><li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status.">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li><li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance.">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li><li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc.">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li><li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy.">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li><li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps.">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production.">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li><li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines.">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li><li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension.">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li><li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes.">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. , (2017).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow.">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li><li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies.">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li><li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li><li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling.">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li><li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation.">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li><li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines:+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay.">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li><li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines.">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li><li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells.">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li></ol>

Düzenlenmiş anlayış redoks sağlık ve hastalık sinyal biyolojik ayarları üretimde serbest radikal değerlendirilmesi önemlidir ama bu tür son derece serbest radikal türlerin kısa yarılanma nedeniyle zorlu ve teknik ölçüsüdür Genel olarak kullanılan sınırlamalarla. EPR redoks biyoloji, değerli ve güçlü bir araç olduğu serbest radikallerin algılamak için sadece belirli bir yöntemdir. Bu projede, biz tasarlama deneyler ve spin kullanarak ROS probları farklı hücresel kompartmanlarda vitro...

Oksidatif stres ve reaktif oksijen türlerine tüm organ sistemleri arasında çeşitli hastalıkları çalışma için önemli olmakla birlikte, reaktif oksijen türleri (ROS) tespiti kısa yarılanma ömrü ve yüksek reaktivite nedeniyle zordur. Serbest radikallerin algılamak için en belirgin yöntemi bir elektron paramagnetic rezonans (EPR) tekniğidir. Spin probları daha yaygın olarak kullanılan floresan problar üstünlükleri vardır. Floresan problar nispeten ucuz ve kullanımı kolay ve hızlı, hassas ROS tespiti sağlamak olsa da, onlar manipülasyonun sinyalleri, ROS konsantrasyonları ve özgüllük1 Genel eksikliği hesaplamak için bir yetersizlik nedeniyle ciddi sınırlamalar var mı .
Biyolojik araştırmalar EPR kullanımını kolaylaştırmak için çeşitli biyolojik ilgili serbest radikal türlerin yanı sıra pO2, pH ve redoks ölçebilirsiniz probları sentezlenmiş spin çeşitli devletler2,3, 4,5,6,7. Spin tuzakları da kısa ömürlü radikaller yakalamak için geliştirilmiştir ve form uzun yaşam adducts, hangi EPR8tarafından algılama kolaylaştırır. Her iki sınıfları (spin probları ve spin tuzakları) avantajları ve sınırlamalar vardır. Bir sık kullanılan spin probları sınıfıdır EPR-sessiz ve kararlı bir nitroxide oluşturmak için kısa ömürlü radikaller ile tepki çevrimsel hydroxylamines. Çevrimsel hydroxylamines süperoksit ile 100 kez spin tuzakları, olanaklı kılmak onları hücresel antioksidanlar ile rekabet edebilmek daha hızlı tepki ancak özgüllüğü eksikliği ve uygun denetimleri ve radikal türler veya kaynak tanımlamak için inhibitörleri kullanılmasını sağlayın nitroxide sinyal için sorumludur. Spin sergi özgüllük yakalar süre ile farklı spektral süperoksit bindirme spin için radikal biyolojik yatkındır için desen kapana kısılmış türler üzerinde bağlı olarak, onlar yavaş kinetik var ve adducts. Uygulamalar için spin bindirme Biyomedikal araştırma9,10,11,12,13' te iyi belgelenmiş oldu.
Bu projenin amacı ve deneyler tasarlamaya yönelik pratik EPR yöntemleri göstermektedir için spin kullanarak süperoksit algılamak için örnek hazırlanması farklı hücresel kompartmanlarda içinde vitro ve farklı doku bölmeleri içinde vivoprobları. Birkaç el yazmaları protokolleri analiz fare modelleri için hedef farklı hücresel kompartmanlarda vitro ve işlem doku hücre geçirgen, hücre geçirimsiz ve mitokondrial hedeflenen spin probları kullanarak bu gol ile ilgili yayınlanan 14 , 15. biz kurmak bu beden edebiyat doğru emin olmak için farklı hücresel kompartmanlarda vitro içinde bir 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonda kullanarak süperoksit ölçmek için bir yaklaşım doğrulayarak ölçümler, sonuçları çarpık olası teknik sorunları vurgulayarak. Ayrıca kan, bronchoalveolar lavaj sıvı ve akciğer doku CMH spin sonda kullanarak EPR ölçümleri gerçekleştirmek için yöntemleri sağlar. Bu çalışmalar doku işlemek gibi başka bir spin robot, CPH, doku hasat önce fareler içine enjekte etmek için bir yöntem sunmak için farklı yöntemler karşılaştırın. Son olarak, politetrafloroetilin (PTFE) boru muhafazası ve transferi önce 77 K. ölçülerde EPR örnekleri için izin vermek için örnekleri depolamak için pratik bir yöntem geliştirmek

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1993px;" width="1994">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:931px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">LifeTech</td>
			<td style="width:224px;">10566-016</td>
			<td style="width:643px;">cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">sodium chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP358-212</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;BP363-500</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td>used to prepare 50 mM phosphate saline buffer&#160; according to Sigma aldrish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Krebs-Henseleit buffer (KHB)&#160;</td>
			<td>(Alfa Aesar, Hill)</td>
			<td>J67820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;S7571-30KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antimycin A (AA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-117-M050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-430-078-M250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-171-M005</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:931px;">1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)</td>
			<td style="width:196px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:224px;">ALX-430-131-M250</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:931px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:224px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Diphenyliodonium chloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>43088</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:931px;">Deferoxamin mesylate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">D9533-1G</td>
			<td style="width:643px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Critoseal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39215003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BRAND disposable BLAUBRAND&#160;micropipettes, intraMark</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>708733</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:931px;">PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 
			3/16&#8221; OD x 1/8&#8221; ID</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>1598774A</td>
			<td>Teflon tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES&#160; FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR</td>
			<td>NORELL</td>
			<td>94987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">EMXnano Bench-Top EPR spectrometer&#160;</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMX NANO TISSUE CELL</td>
			<td>Bruker BioSpin GmbH</td>
			<td>E7004542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of electron paramagnetic resonance in biological samples at ambient temperature and 77 k

Reaktif oksijen türleri (ROS) farklı cep ve doku bölmeleri içinde doğru ve belirli algılama redoks düzenlenir sinyal biyolojik ayarlarında çalışması esastır. Elektron paramagnetic rezonans sprektroskopisidir (EPR) serbest radikallerin belirsizliğe yer bırakmadan değerlendirmek için yalnızca doğrudan yöntemidir. Onun avantajı yüksek özgüllük ile belirli türlerin fizyolojik düzeyleri algılar, ama özel teknolojisi, dikkatli numune hazırlama ve uygun denetimleri doğru verilerin yorumlanması sağlamak için gerektirir. Çevrimsel hydroxylamine spin probları seçerek süperoksit veya EPR spektroskopisi tarafından sayısal bir nitroxide sinyal oluşturmak için diğer radikalleri ile tepki. Hücre geçirgen spin probları ve spin probları hızla mitokondri içinde birikir için tasarlanmış farklı hücresel kompartmanlarda süperoksit konsantrasyon belirlenmesi için izin verir.
Kültürlü hücreleri, hücre geçirgen 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) ile birlikte ve hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz (SOD) Önarıtma olmadan kullanımı veya hücre geçirgen PEG-SOD kullanımı, sağlar ekstrasellüler sitozolik süperoksit üzerinden farklılaşma. Mitokondriyal 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium ve (mito-TEMPO-H) için ölçüm sağlar Mitokondrial ROS (ağırlıklı olarak süperoksit).
Spin sonda ve EPR spektroskopisi vivo içinde modelleri için de uygulayabilirsiniz. Süperoksit ekstraselüler sıvı kan ve alveoler sıvı gibi yanı sıra doku akciğer dokusu gibi algılanabilir. Birkaç yöntem işlemek ve doku EPR ölçümler için depolamak ve intravenöz 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonda içinde vivoteslim için sunulmaktadır. Ölçümler-ebilmek var olmak kılınmak oda sıcaklığında iken, vitro ve in vivo modellerden alınan örnekleri de-80 ° C'de saklanabilir ve 77 K. EPR tarafından analiz Örnekleri özel boru istikrarlı-80 ° C'de depolanan ve bir pratik, verimli, etkinleştirmek için 77 K ve depolama ve aktarma örnekleri kolaylaştırır tekrarlanabilir yöntemini çalıştırın.

CMH süperoksit algılama doğrulanmış X kullanarak / XO süperoksit üreten katalaz (Şekil 1A) etkisi varken nitroxide (CM.) sinyal SOD tarafından inhibe tam olarak göstermek için sistem. Toplam, hücre dışı süperoksit, hücre geçirgen CMH spin sonda SOD Önarıtma +/-ile sonra çiğ 264.7 hücreleri kuluçka hücreleri tarafından değerlendirilmiştir. Nitroxide konsantrasyonu hücre süspansiyon ve iki örnek türü değerleri benzer...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K at JoVE.com

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Disregulated redoks sinyalizasyonu çeşitli hastalıkların patogenezinde yer almaktadır. Redoks biyolojisi çalışması, farklı hücresel ve doku bölmelerinde reaktif oksijen türlerinin doğru bir şekilde saptanmasıdır. EPR spektroskopisi serbest radikalleri kesin olarak ölçen tek yöntemdir.Bu protokol, EPR spektroskopisi için biyolojik numunelerin işlenmesi ve saklanması için pratik bir yöntem göstermektedir. Bu protokoller, iki temsili modelde EPR ve spin problarının kullanımını göstermektedir. Her ne kadar diğer biyolojik ortamlarda aktif türleri değerlendirmek için adapte edilebilir.Deneyin tasarımı ve numunenin işlenmesi, denemenin tekrarlanabilirliği açısından çok önemlidir. Hücre yoğunluğunu göz önünde bulundurmanızı ve uygun zaman uyumlu kontrolleri sağlamanızı öneririz. Yavaşça iyi başına Krebs-Henseleit Tampon veya KHB bir mililitre ile ham 264,7 hücreleri yıkama ile başlayın.Ve 500 mikrolitre KHB ile hücreleri tedavi, iyi başına 100 mikromil DTPA ile desteklenmektedir. Süperoksit dismutaz ile pretreat için, süperoksit dismutaz stok, ya da araç 15 mikrolitre ekleyin, her kuyu, ve 10 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirin. Süperoksit dismutaz ön işlem sonunda, 10 milimolar CMH 12,5 mikrolitre ve uygun kuyulara 125 mikromolar PMA çalışma çözümü 40 mikrolitre ekleyin ve 50 dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka.Hemen buz üzerine plakaları yerleştirin ve buz üzerinde ayrı 1,5 mililitre tüpler içine her kuyudan tampon toplamak. Daha sonra, her iyi taze KHB artı DTPA 100 mikrolitre ekleyin ve yavaşça her kuyunun altından hücreleri kazıyın. Daha sonra pipetleme ile hücre süspansiyonları resuspend ve buz üzerinde bireysel 1,5 mililitre tüpler içine hücreleri aktarın.Oda sıcaklığında süperoksit tespiti için, ilk olarak bir tampon veya hücre örneğinin 50 mikrolitresini kılcal bir tüpe yükleyin ve tüpü kapatın. Tüpü hemen elektron paramanyetik rezonansına veya EPR spektrometresine yerleştirin ve oda sıcaklığı ölçümleri için EPR kazanım parametrelerini ayarlayın. Her zaman bir kontrol olarak aynı deneysel koşullar altında tedavi prob aynı konsantrasyoniçeren tampon boş bir örnek test edin.77 derece Kelvin'de süperoksit tespiti için, bir numunenin 150 mikrolitresini bir ucunda kauçuk durdurucu ile bir ila iki inçlik düz politetrafloroetilen veya PTFE parçasına yükleyin. Tüpün diğer ucunu ikinci bir stoperle kapatın ve numuneyi sıvı nitrojenle dondurun. Daha sonra hızlı bir şekilde stoperleri çıkarın ve ptfe tüpünü sıvı nitrojen depolaması için etiketli bir kriyotube yerleştirin.EPR ölçümleri için, EPR spektrometresinin parmak dewar'ını sıvı nitrojenle doldurun ve numuneyi içeren PTFE boruyu sıvı nitrojene yerleştirin. Parmak dewar'ı EPR spektrometresine yerleştirin ve Ölçümler için EPR kazanım parametrelerini 77 derece Kelvin olarak ayarlayın. Dondurulmuş akciğer dokusunda ROS algılama için, kuru buz üzerinde doku yerleştirin ve kuru buz üzerinde flaş dondurulmuş doku stabilize etmek için cımbız kullanın.Beş 15 miligram parçalar halinde örnek kesin ve bir katranlı 1.5 mililitretüp parçaları tartmak. Numuneye 196 mikrolitre KHB artı DTPA ve dört mikrolitre CMH ekleyin ve kısa bir santrifüj ile doku parçalarını peletleme den önce 37 derece santigrat su banyosunda bir saat boyunca akciğer örneğini kuluçkaya yatırın. Daha sonra sadece gösterildiği gibi EPR ölçüm hazırlanmasında flaş dondurma için PTFE boru bir parça içine supernatant 150 mikrolitre aktarmadan önce buz üzerinde örnek yerleştirin.Gösterildiği gibi PMA ile uyarılmış ham 264,7 hücrelerde toplam süperoksit üretiminin değerlendirilmesi, hem hücre süspansiyonu hem de PMA ile tedavi edilen hücrelerin tampon azot konsantrasyonunun, geçirilebilir doğası ve spin probunun hızlı dengesi nedeniyle benzer olduğunu ortaya koymaktadır. Nitroksit radikalleri sinyal ham artar 264.7 PMA ile uyarılmış hücreler, kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, ama hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz ile önceden tedavi hücrelerde. PMA ile uyarıldıktan sonra ham 264.7 hücrelerde düşük sıcaklıklarda elde edilen nitroksit konsantrasyonu da oda sıcaklığı verileri ile tutarlı süperoksit dismutaz varlığında zayıflatılır.Nitroksit konsantrasyonu kan ve bleo fareler ve tedavi farelerin bronkoalveolar lavaj sıvısı artar, yanı sıra bleo fareler ve yaralı hayvanlardan hasat akciğer dokusu parçalarının supernatants içinde, PBS tedavi kontrolleri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, retro-orbital spin prob enjeksiyonundan sonra, bleo fareler ve tedavi edilen hayvanlar kontrollere göre daha yüksek bir spin sonda sinyali gösterirler. Bu pratik protokoller, araştırmacıların düşük sıcaklık ölçümleri de dahil olmak üzere farklı hücresel bölmelerde ve biyolojik numunelerde serbest radikal üretimini EPR ile test edebilmelerine olanak sağlayacaktır.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

Sources of Magnetic Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...